雙條杉天牛幼蟲人工飼料的篩選

耿涌鑫 楊錦 朱知睿 魏丹峰 陳敏

摘要 雙條杉天牛Semanotus bifasciatus （Motschulsky）是柏科樹木最嚴重的鉆蛀性害蟲之一。開發(fā)雙條杉天牛的人工飼料是開展該害蟲防治技術研究及生物學相關基礎研究的重要條件。本研究在參考了其他天牛人工飼料配方的基礎上，采用正交試驗設計方法設計飼料配方，通過對不同配方飼料對雙條杉天牛幼蟲的飼養(yǎng)效果進行比較和極差分析，最終篩選出雙條杉天牛幼蟲的人工飼料最優(yōu)組合為：瓊脂4.7%、蔗糖3.5%、對羥基苯甲酸甲酯0.5%、酵母粉3.1%、柏樹木粉30%、抗壞血酸0.5%以及水。使用該人工飼料可將雙條杉天牛幼蟲成功喂養(yǎng)至羽化，并且蛹羽化率高達81.25%， 總成活率為54.16%。本研究的結果可為天?？破渌炫Ｈ斯わ暳系拈_發(fā)提供借鑒。

關鍵詞 雙條杉天牛； 人工飼料； 正交試驗； 極差分析

中圖分類號： S 433.5

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017095

Abstract Semanotus bifasciatus （Coleoptera： Cerambycidae） is one of the most serious stem borers in Cupressaceae trees. Development of artificial diets for S. bifasciatusis is important for further studies on its control strategies and biology. The orthogonal design was used in this research to develop the feed formula based on several feed recipes for long-horned beetles. According to the results of the screening tests， we improved the diet formula and finally obtained an optimal diet formula for S. bifasciatus larvae. The optimal formula was as followed： agar 4.7%， sucrose 3.5%， methyl p-hydroxybenzoate 0.5%， yeast powder 3.1%， Platycladus orientalis wood sawdust 30%， ascorbic acid 0.5% and distilled water 57.7%. This diet could feed the larvae from the initial incubation to pupae successfully， and the pupal emergence rate was as high as 81.25%， with a final survival rate up to 54.16%. The results provide a reference for the development of artificial diets for other long-horned beetles.

Key words Semanotus bifasciatus； artificial diet； orthogonal analysis； range analysis

雙條杉天牛Semanotus bifasciatus （Motschulsky）屬鞘翅目Coleoptera天牛科Cerambycidae，是我國林業(yè)上一種重要的毀滅性鉆蛀害蟲， 1996年被確定為我國林業(yè)有害生物檢疫對象。2013年國家林業(yè)局在對林業(yè)有害生物進行全面的風險分析的基礎上，又將雙條杉天牛列入全國林業(yè)危險性有害生物名單[14]。雙條杉天牛在我國主要寄主為側柏Platycladus orientalis （Linn.） Franco、圓柏Sabina chinensis （Linn.） Antoine、龍柏S.chinensis （Linn.） Ant. cv. Kaizuca Hort.等柏類和杉木Cunninghamia lanceolata （Lamb.） Hook.類樹種[1， 56]。雙條杉天牛主要以幼蟲在枝、干的皮層和邊材部位蛀食為害，破壞樹木的輸導功能，導致受害木長勢衰退，易造成雪折、風折，甚至呈現(xiàn)整株樹木或整片林子死亡[67]，嚴重影響樹木的正常生長以及景觀效果，尤其危及柏類和杉木古樹名木的存活[810]。同時，由于蛀干害蟲的發(fā)育周期較長，采集困難等原因，給野外的防治研究造成很大困難。因此，研制優(yōu)良的雙條杉天牛人工飼料，探索雙條杉天牛的人工飼養(yǎng)方法，成為雙條杉天牛防治技術研究的基礎。

昆蟲基礎研究和害蟲防控技術研究，需要大量的生理指標統(tǒng)一的試蟲。人工飼料不僅可以飼養(yǎng)發(fā)育整齊的昆蟲，還不受季節(jié)性飼料短缺的限制，實現(xiàn)昆蟲的連續(xù)飼養(yǎng)，可滿足相關科學研究的持續(xù)開展[1113]。鱗翅目以及膜翅目等農(nóng)林業(yè)害蟲以及一些天敵昆蟲的人工飼養(yǎng)已經(jīng)趨于成熟與完善，進入規(guī)?；a(chǎn)研究階段[1416]，但是鞘翅目天?？评ハx，尤其蛀干害蟲由于取食環(huán)境特殊，以及幼蟲隱蔽的生活習性，使用人工飼料飼養(yǎng)相對困難[1718]。目前，已經(jīng)成功開發(fā)了幾種天牛，如黃斑星天牛Anoplophora nobilis Ganglbauer、槐綠虎天牛Chlorophorus diadema Motsch.、光肩星天牛Anoplophora glabripennis （Motschulsky）等的人工飼料[1929]。

本研究在綜合參考以上幾種天牛的人工飼料配方和幼蟲飼養(yǎng)方法的基礎上，初步設計了雙條杉天牛幼蟲的人工飼料配方。采用正交試驗對多因素多個水平進行綜合評價，以尋找各因素的最佳組合和水平，在試驗的過程中不斷地進行改進，通過對飼料配方中的元素和配比進行優(yōu)化，進而應用生物統(tǒng)計學方法[30]對優(yōu)化后的飼料配方的飼養(yǎng)效果進行綜合評價，最終獲得雙條杉天牛完成幼蟲發(fā)育至羽化的最佳人工飼料配方。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

2016年3月-4月從頤和園和天壇公園的側柏誘餌木上收集雙條杉天牛成蟲，將1雌1雄兩兩配對分別放入布丁杯中（杯底直徑3 cm，杯口直徑5 cm，高4 cm），用10%的蜂蜜水飼喂，待其交尾產(chǎn)卵后收集卵粒至新的布丁杯中。布丁杯中放入吸水脫脂棉以保持足夠的濕度，于人工氣候箱中，25℃濕度75%，黑暗飼養(yǎng)。待卵孵化后，挑選同一時期孵化的幼蟲進行人工飼料篩選試驗。

1.2 人工飼料配方和飼養(yǎng)方法

1.2.1 試驗材料預處理

將柏木段樹皮和木質(zhì)部分離后，將木質(zhì)部放入烘箱，60℃處理24 h，磨碎過80目篩，將木粉放入1 L三角瓶中，120℃下滅菌20 min。

1.2.2 飼料配方設計

利用正交試驗方法對多因素多水平進行考察以期找出適合飼養(yǎng)雙條杉天牛幼蟲的最優(yōu)配方搭配。本次試驗依據(jù)王延年的昆蟲人工飼料手冊[11]，以及參考了星天牛、光肩星天牛、槐綠虎天牛等天牛的人工飼料配方的成分和配比[1929]，設定的飼料配方中主要成分為：瓊脂、蔗糖、對羥基苯甲酸甲酯、酵母粉、柏樹木質(zhì)部、抗壞血酸、黃豆粉以及水。按照曹利軍等[24]的正交試驗設計方法，將第1次試驗設為7因子3水平正交試驗（表1），選擇正交表L18（37），共18個處理（表2）。根據(jù)確定的正交試驗方案，對雙條杉天牛初孵幼蟲進行室內(nèi)的人工飼養(yǎng)試驗。根據(jù)試驗統(tǒng)計結果確定進一步優(yōu)化的因素和水平（優(yōu)化結果見表3），其中根據(jù)第一次的正交試驗結果將營養(yǎng)元素A瓊脂、D抗壞血酸和E酵母粉選取最佳水平進行固定。將剩余的4個營養(yǎng)因素設計根據(jù)正交表L9（33）設計第2次正交試驗，如表4所示。按照第2次正交試驗方案，從野外獲取雙條杉天牛幼蟲，選取和第1次正交試驗結束時幼蟲頭殼寬一致（1.1～1.4 mm）的試蟲進行飼養(yǎng)試驗。每天觀察幼蟲的存活和化蛹情況，并記錄每頭幼蟲的存活時間，定期統(tǒng)計記錄每組試蟲的存活率、體重和化蛹率等指標，以便于對試驗進行評估。本研究試驗過程中若出現(xiàn)有超過半數(shù)（及9組以上）的幼蟲平均成活率小于50%，則視為本次試驗的飼料配方需要改進，則試驗結束，繼續(xù)改進飼料配方進行試驗。然后計算各水平在本試驗階段的平均值。通過比較各水平和各因素的平均值，確定每一營養(yǎng)因素的最優(yōu)水平，各營養(yǎng)因素的最優(yōu)水平組合成該人工飼料配方的最佳搭配。計算并比較分析各水平平均值間的極差，得出影響試驗結果最關鍵的因子。本試驗將平均體重增加最多、平均存活時間最長、成活率（每個試驗階段歷期的總成活率）最高作為各因素最佳水平的標準。

1.2.3 飼料的配制

按照表2的設計依次配制18組飼料。首先稱取黃豆粉、酵母粉、蔗糖，放入容器中混合均勻，記為M組。稱取抗壞血酸、對羥基苯甲酸甲酯混均記為N組，并先將N組元素溶于70%的乙醇中。根據(jù)表中每組飼料所對應的水量準確稱取瓊脂和柏木粉，將瓊脂放入盛有蒸餾水燒杯中，用微波爐加熱煮沸，再加入M組組分，充分攪拌再次煮沸。冷至55℃左右加入N組攪拌均勻，最后加入柏木粉充分攪拌，倒入儲藏飼料的容器（布丁杯），待冷卻至室溫時，蓋上杯蓋，放入4℃冰箱保存，以備換飼料的時候隨用隨取。為保證飼料的新鮮，飼料的保存時間應不超過1個月。為避免飼料污染，飼料的配制應在無菌環(huán)境下進行。

1.2.4 試蟲飼養(yǎng)方法

參照尹新明等[27]管式飼養(yǎng)天牛的方法，將雙條杉天牛幼蟲飼養(yǎng)在1.5 mL的離心管中。首先在離心管底部剪一透氣孔，塞上一小團脫脂棉以防止飼料漏出或幼蟲逃逸，再將制作好的18種飼料分別裝入1.5 mL的離心管，將飼料壓實，以模擬幼蟲在自然界的取食環(huán)境，同時在飼料上挖一小槽便于幼蟲的取食和鉆入。選取初孵天牛幼蟲接入離心管內(nèi)，每管一頭，每組18頭，于人工氣候箱中（25℃，75%濕度）黑暗飼養(yǎng)。

飼養(yǎng)過程中，每天觀察飼料的狀況和幼蟲的取食情況，如遇到飼料發(fā)霉、失水和幼蟲死亡情況應及時做好記錄，并更換飼料。每天觀察幼蟲的存活和蛻皮情況并做記錄。每5 d測量每頭試蟲的體重。

1.2.5 飼料配方的優(yōu)化和檢驗

根據(jù)第2次正交試驗的分析結果對飼料配方進行優(yōu)化。從側柏誘木上解剖獲取雙條杉天牛幼蟲，選取和第2次正交試驗結束時幼蟲頭殼寬大小一致（2.5～2.6 mm）的幼蟲作為試蟲，用該飼料對幼蟲進行飼養(yǎng)（一組16頭，設3組），記錄雙條杉天牛幼蟲的成活數(shù)、成蛹數(shù)和羽化數(shù)等生長發(fā)育的指標數(shù)據(jù)。對數(shù)據(jù)進行分析并檢驗該飼料飼養(yǎng)雙條杉天牛的總成活率，以對此次配方進行綜合評價。

2 結果與分析

2.1 第一次正交試驗結果分析

18種配方的人工飼料分別飼養(yǎng)雙條杉天牛幼蟲45 d后，計算45 d時的幼蟲存活率、幼蟲平均存活時間和平均體重增加量各項生長發(fā)育指標（表5）。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，1號、5號、10號、12號和18號5種飼料飼養(yǎng)6日后幼蟲全部死亡，其余13個配方的人工飼料飼養(yǎng)的幼蟲平均存活時間為7.2～22.2 d，平均體重均有增長，增長率為0.18%～0.56%。將各因素在不同水平下出現(xiàn)最佳的次數(shù)進行了統(tǒng)計，結果見表7。同時通過極差分析，得出本次試驗中影響幼蟲生長發(fā)育最主要的因素為對羥基苯甲酸甲酯（表6）。

根據(jù)表7的頻次分布，將出現(xiàn)頻次高的因素作為最優(yōu)水平固定下來，進而對該飼料配方各因素水平進行進一步的優(yōu)化。本研究中先將影響試驗結果較小的非關鍵營養(yǎng)元素瓊脂、抗壞血酸、酵母粉選取最佳水平進行固定，接下來還需對對羥基苯甲酸甲酯、黃豆粉、柏木粉和蔗糖進行進一步優(yōu)化。

2.2 第2次正交試驗結果與分析

第2次正交試驗的9個處理，統(tǒng)計天數(shù)為50 d，所有配方的飼料飼養(yǎng)的雙條杉天牛幼蟲成活率均高于60%（成活率為每個處理50 d的平均成活率），最高達83.33%（見表8）。將表9各因素在不同水平出現(xiàn)最佳的次數(shù)進行了統(tǒng)計，并記錄在表10中，從中得出最優(yōu)的飼料配方和配比組合（表11）。通過極差分析得出在雙條杉天牛幼蟲的生長發(fā)育過程中，飼料配方的7個因素中影響雙條杉天牛幼蟲的成活率最關鍵的因素是對羥基苯甲酸甲酯，影響存活時間的關鍵因子是對羥基苯甲酸甲酯和柏木粉，影響體重增加的關鍵是蔗糖。

2.3 優(yōu)化飼料配方驗證

用表11中的飼料配方對雙條杉天牛幼蟲進行飼養(yǎng)效果檢驗。結果表明，該配方可以成功地將雙條杉天牛幼蟲飼養(yǎng)至成蟲羽化，飼養(yǎng)的試蟲在成活率（83.33%）、成蛹率（80%）、羽化率（81.25%）等方面均表現(xiàn)良好（詳見表12）。

3 討論

本研究以雙條杉天牛幼蟲作為研究對象，通過兩次正交試驗，分別設計了18種和9種飼料配方，根據(jù)各飼料飼養(yǎng)雙條杉天牛幼蟲存活率、平均存活時間、平均體重增加量等指標，通過統(tǒng)計學分析，最終鎖定影響試驗結果的主要因素和獲得雙條杉天牛完成幼蟲發(fā)育至羽化的最佳配方。

雙條杉天牛的卵和幼蟲在室內(nèi)比較穩(wěn)定的環(huán)境條件下孵化率和成活率要明顯高于野外條件下的成活率。調(diào)查結果顯示雙條杉天牛卵的室內(nèi)孵化率達97%以上[3132]，而野外的平均孵化率僅為70%[9]；由于野外自然條件不可控因素較多，雙條杉天牛在野外的死亡率普遍較高，達56%～85%[31]，梁修山等[9]在林間調(diào)查的存活率為32.23%，在室內(nèi)用木段飼養(yǎng)的成化率（成蟲羽化孔數(shù)與幼蟲蛀食道數(shù)之比）為37.25%，從卵到羽化的總存活率僅為13.04%[9]。本試驗中得出的最優(yōu)配方可以將天牛的幼蟲飼養(yǎng)至羽化，幼蟲成活率為83.33%，且羽化率為81.25%，總存活率為54.16%。

本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中營養(yǎng)成分的配比對昆蟲的生長發(fā)育有重大影響。第1次正交試驗18個處理僅有3個處理的幼蟲飼養(yǎng)成活率高于50%；當較大比例的組分固定后進行第2次正交試驗時，所有處理均能將雙條杉幼蟲的成活率提高至60%以上；對少量成分進一步優(yōu)化之后得到的飼料配方可以將雙條杉天牛飼養(yǎng)至完成羽化。因此，只有提供給昆蟲合適的營養(yǎng)組分比例才能保證昆蟲正常的生長發(fā)育對均衡營養(yǎng)的需求，達到昆蟲所需的營養(yǎng)水平[33]。

飼料的配方在滿足昆蟲的營養(yǎng)需求的同時，還應有良好的防腐效果[3334]。飼料中適當?shù)姆栏瘎┑奶砑涌裳娱L飼料的保質(zhì)期和飼料更換周期，一定程度上降低人工飼養(yǎng)的成本[35]。有報道指出造成雙條杉天牛幼蟲和蛹死亡的最主要原因是真菌[36]。本研究也發(fā)現(xiàn)，防腐物質(zhì)對羥基苯甲酸甲酯是試驗中的關鍵因子。第1次正交試驗中，18種飼料中有5種飼料飼養(yǎng)的幼蟲在接蟲第6天統(tǒng)計死亡率為100%，主要原因是對羥基苯甲酸甲酯的添加量過少，飼料被真菌污染、腐敗變質(zhì)的速度非?？?，2～3 d后出現(xiàn)霉變，需要經(jīng)常更換飼料，嚴重影響幼蟲的正常生長發(fā)育，甚至導致雙條杉天牛幼蟲死亡。第2次正交試驗提高了飼料配方中對羥基苯甲酸甲酯的百分比，幼蟲的成活率有所提高，但是體重呈現(xiàn)了負增長。可見防腐劑添加量可對昆蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。

目前報道的人工飼料專利配方大多用于科研，很少應用于規(guī)?；a(chǎn)，主要原因是飼料配方的制作成本較高（人工和原料）、市場需求小[37]。因此飼料成分越簡單，成本越低廉，越便于大規(guī)模的生產(chǎn)。與現(xiàn)有的天?？破渌紫x人工飼料的專利配方相比，本試驗的配方相對來說成分組成相對更簡單，與槐綠虎天牛和光肩星天牛的成分相近[23， 38]。其中光肩星天牛飼料配方中防腐劑用的是對羥基苯甲酸甲酯和山梨酸，其余成分和本研究中的飼料成分相同。試蟲寄主因子占比較重，同時飼料成分的減少降低了飼料制作的成本。用此飼料配方飼養(yǎng)幼蟲要比之前利用天然木段飼養(yǎng)雙條杉天牛的幼蟲更利于試驗的觀察，且飼養(yǎng)方法操作比較簡便，為今后大規(guī)模的生產(chǎn)奠定基礎。目前，該人工飼料已用于Bt毒蛋白對雙條杉天牛初孵幼蟲的室內(nèi)生物活性測定試驗，對照試驗組的試蟲死亡率小于20%，達到了室內(nèi)生測對對照組的要求（待發(fā)表試驗數(shù)據(jù)），該結果結合對飼料配方的飼養(yǎng)檢驗結果，表明該飼料配方可以成功完成雙條杉天牛幼蟲期的飼養(yǎng)。本研究的試驗設計方法和營養(yǎng)元素配比方案將會為今后研制其他天牛或昆蟲人工飼料提供參考，也將為害蟲的生物防治等基礎提供新的思路。

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