短時高溫脅迫對雙斑長跗螢葉甲雌蟲游離氨基酸、海藻糖和可溶性糖的影響

馬曉江 張志虎 王中 張艷香 陳靜

摘要 雙斑長跗螢葉甲是新疆北疆棉花的主要害蟲之一，為探索短時高溫對雙斑長跗螢葉甲雌蟲部分生理指標(biāo)的影響，在室內(nèi)研究了不同高溫（33、37、41、45℃）不同時間（0.5、1.5、2.5、6、12 h）處理?xiàng)l件下，雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)游離氨基酸、可溶性糖及海藻糖的變化規(guī)律。結(jié)果表明：在相同溫度處理下，隨處理時間的延長，雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)的游離氨基酸含量降低，可溶性糖和海藻糖含量增加；在處理時間相同時，隨處理溫度的升高，雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)游離氨基酸含量降低，可溶性糖含量和海藻糖含量增加。雙斑長跗螢葉甲雌蟲對45℃高溫也有一定的適應(yīng)性，這預(yù)示著在氣候變暖趨勢下，雙斑長跗螢葉甲仍將是新疆棉花上重要的害蟲之一。

關(guān)鍵詞 雙斑長跗螢葉甲； 高溫暴露； 游離氨基酸； 可溶性糖； 海藻糖

中圖分類號： S 435.622

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017120

Abstract Monolepta hieroglyphica （Motschulsky） is one of the most serious pests in cotton fields in the north of Xinjiang. This study was aimed to explore the potential physiological and biochemical responses of female adult M. hieroglyphica exposed to high temperature.The variation in free amino acids， total sugar and trehalose in female adult bodies were measured under climate chamber conditions under consistent temperature regimes of 33-45℃ at 4℃ intervals for 0.5 h， 1.5 h， 2.5 h， 6 h and 12 h， respectively.Under the same heat treatment， with the extension of treatment time， the concentration of free amino acids was decreased， while the concentrations of total sugar and trehalose were increased in female adult M. hieroglyphica. For the same treatment time， with rising temperature， the concentration of free amino acids was reduced， but the concentrations of total sugar and trehalose were increased in female adult M. hieroglyphica. M. hieroglyphica even had a certain adaptability to 45℃， and thus is a serious pest to the cotton in Xinjiang under global climate warming.

Key words Monolepta hieroglyphica； high temperature exposure； free amino acid； total sugar； trehalose

雙斑長跗螢葉甲Monolepta hieroglyphica （Motschulsky）屬鞘翅目Coleoptera，葉甲科Chrysomelidae，長跗螢葉甲屬M(fèi)onolepta Chevrolat，又稱雙斑螢葉甲。該蟲在國內(nèi)主要分布于甘肅、寧夏、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西和陜西等21個省/自治區(qū)[14]。近些年，新疆棉區(qū)棉花耕作方式的改變，棉花種植的集中化及品種的單一化為雙斑長跗螢葉甲提供了良好的生存環(huán)境，使該葉甲種群迅速擴(kuò)散蔓延，成為北疆棉區(qū)主要害蟲之一[5]。雙斑長跗螢葉甲以成蟲取食棉花葉片，造成棉花葉片表面形成缺刻，甚至壞死斑，使棉花的光合作用受到嚴(yán)重影響，從而給棉花的生產(chǎn)帶來巨大損失[67]。目前，有關(guān)雙斑長跗螢葉甲的研究主要集中于其發(fā)生規(guī)律、寄主范圍、防治方法等[3， 78]。

昆蟲屬變溫動物，環(huán)境溫度是影響其生長、發(fā)育、存活及生殖等生命活動的重要因素。當(dāng)環(huán)境溫度超過其適宜溫區(qū)，就會造成熱脅迫。有關(guān)環(huán)境溫度對雙斑長跗螢葉甲的影響，僅有對其成蟲壽命、繁殖和種群動態(tài)的研究[2，9]，而由于氣候變暖帶來的高溫頻率增加和日高溫升高對雙斑長跗螢葉甲的影響尚未見報道。

本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下采用不同高溫與不同時間處理，研究短時高溫暴露條件下雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)可溶性糖、游離氨基酸和海藻糖的變化，以期考查雙斑長跗螢葉甲對高溫脅迫的適應(yīng)能力，同時對解析該蟲的耐熱性及夏季田間種群數(shù)量動態(tài)，制定適宜的防治策略具有重要意義，也為進(jìn)一步研究高溫對雙斑長跗螢葉甲影響的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

雙斑長跗螢葉甲成蟲采自新疆石河子大學(xué)試驗(yàn)站（43°20′N， 84°45′E）棉田，在自制的養(yǎng)蟲盒（10 cm×6 cm×6 cm）內(nèi)用棉花葉片飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：PXZ型智能人工氣候箱，溫度26℃ ± 1℃，光周期L∥D=16 h∥8 h，相對濕度（RH）為 （80% ± 5%）。

1.2 試驗(yàn)材料及儀器

游離氨基酸測定試劑盒和蛋白質(zhì)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；可溶性糖測定試劑盒，上海嵐派生物科技有限公司生產(chǎn)；海藻糖測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；TGL-16gR型離心機(jī)，UV1800型分光光度儀，Varioskan flash 3001型酶標(biāo)儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高溫處理方法

試驗(yàn)設(shè)33、37、41、45℃ 4個溫度處理，溫度誤差 ± 1℃。每個溫度分別設(shè)0.5、1.5、2.5、6、12 h 5個處理時間（處理于每日10：00開始）。分別測定不同溫度處理不同時間后雙斑長跗螢葉甲雌蟲游離氨基酸、可溶性糖和海藻糖濃度的變化。每個處理重復(fù)3次，每次30頭成蟲。

1.3.2 游離氨基酸的測定方法

用10 mL離心管稱取6～8頭經(jīng)短時高溫處理的雙斑長跗螢葉甲雌蟲活體按質(zhì)量體積比加入9倍生理鹽水，冰水浴條件機(jī)械勻漿制成10%勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白質(zhì)及游離氨基酸含量。

蛋白質(zhì)含量測定：取10%勻漿加入9倍生理鹽水稀釋成1%組織勻漿，然后分別取0.05 mL勻漿液、0.05 mL雙蒸水（空白管）、0.05 mL 0.563 g/L蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)管）于試管中，依次加入3 mL考馬斯亮藍(lán)顯色液，混勻，靜置10 min，在波長595 nm，光徑1 cm，雙蒸水調(diào)零后測定各管吸光度值，并計算蛋白質(zhì)含量。

游離氨基酸含量測定：按照游離氨基酸測定試劑盒說明書對樣品組織10%勻漿進(jìn)行處理。波長650 nm，光徑1 cm，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度值。

蛋白濃度（g/L）=（OD樣品-OD空白）×0.563/（OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白），式中0.563為標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度，單位g/L。

游離氨基酸含量（μmol/mg）=（OD樣品-OD空白）/（OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白）×50/該樣品的勻漿蛋白濃度（g/L），式中50為游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度，單位μmol/mL。

1.3.3 海藻糖的測定

采用蒽酮比色法。稱取約0.1 g雙斑長跗螢葉甲活雌蟲，常溫研碎，加入1 mL提取液，室溫靜置45 min，振蕩 3～5次，冷卻后，1 000 r/min常溫離心10 min，取上清液按照可溶性糖測定試劑盒說明書的步驟進(jìn)行處理。測定波長620 nm，光徑1 cm，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度值。

海藻糖含量（mg/g鮮重）=[V1×（OD樣品-0.072 9）/8.897 6]/（W×V1/V2）=0.112×（OD樣品-0.072 9）/W，式中，V1為反應(yīng)體系中樣品體積0.06 mL，V2為提取液總體積1 mL，W為樣品質(zhì)量。

1.3.4 可溶性糖的測定

用1.5 mL離心管稱取6～8頭經(jīng)短時高溫處理的雙斑長跗螢葉甲活雌蟲按重量體積比加入4倍生理鹽水，制成20%勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液待測。將可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋成240、120、60、30、15 ng/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)液各50 μL。將樣品上清液及標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照可溶性糖測定試劑盒說明書的步驟依次加入酶標(biāo)板中，以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中昆蟲可溶性糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。不同溫度和處理時間對雙斑長跗螢葉甲雌蟲游離氨基酸、可溶性糖和海藻糖的影響采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（α=0.05）。采用Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫下雙斑長跗螢葉甲雌蟲游離氨基酸含量的變化

經(jīng)短時高溫處理后，與對照（26℃）相比，33、41、45℃下處理不同時間雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)游離氨基酸含量隨處理時間的延長而減少，除33℃處理0.5 h外其他處理均顯著低于26℃對照，且呈現(xiàn)出處理時間越長，游離氨基酸含量下降幅度越大的趨勢。37℃處理除了1.5 h游離氨基酸含量與對照26℃無顯著差異外，其他處理時間均顯著低于對照（圖1）。45℃處理2 h后雙斑長跗螢葉甲雌蟲全部死亡。

處理時間為0.5 h和2.5 h時，雙斑長跗螢葉甲成蟲體內(nèi)的游離氨基酸含量表現(xiàn)為隨處理溫度的升高而降低。處理1.5 h時游離氨基酸含量以37℃處理的最高，顯著高于其他溫度處理，33、41、45℃處理差異不顯著。處理6 h時，33、37和41℃處理下的成蟲體內(nèi)游離氨基酸含量無顯著差異。處理12 h時，41℃處理的游離氨基酸含量顯著高于37℃處理，與33℃處理無顯著差異（圖1）。

2.2 高溫脅迫下雙斑長跗螢葉甲雌蟲海藻糖含量的變化

在同一短時高溫（33、37或者45℃）處理下，與對照溫度（26℃）相比，雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)的海藻糖含量均隨處理時間延長而增加，并且處理時間越長上升幅度越大，而在41℃處理下雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)海藻糖含量先升高后降低再升高（圖2）。試驗(yàn)中，雙斑長跗螢葉甲雌蟲在45℃處理2 h后全部死亡。

在處理時間為0.5、1.5、6或者12 h時，雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)的海藻糖含量均隨處理溫度的升高而增加，并且處理溫度越高上升幅度越大，在處理時間為2.5 h時，雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)的海藻糖含量隨溫度增加先升高后降低，但仍高于對照（圖2）。

2.3 高溫脅迫下雙斑長跗螢葉甲雌蟲可溶性糖含量的變化

在同一短時高溫（33、37或者45℃）處理下，與對照溫度（26℃）相比，雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)的可溶性糖含量呈現(xiàn)隨處理時間的延長而增加的趨勢，而在41℃處理下雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)可溶性糖含量先升高后降低再升高（圖3）。試驗(yàn)中，雙斑長跗螢葉甲雌蟲在45℃處理2 h后全部死亡。

處理時間為0.5 h和1.5 h時，雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)的可溶性糖含量均隨處理溫度的升高而增加，并且處理溫度越高上升幅度越大；處理2.5 h時，雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)的可溶性糖含量隨處理溫度的升高先升高后降低，但仍高于對照；處理6 h時，33、37、41℃下雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)的可溶性糖含量之間無顯著差異（圖3）。

3 討論

在全球氣候變暖的大環(huán)境下，多種昆蟲耐熱性的增強(qiáng)以及耐受溫度范圍的拓寬都表現(xiàn)出了昆蟲對溫度的適應(yīng)性。雙斑長跗螢葉甲在33、37、41、45℃高溫短時處理?xiàng)l件下，只有在45℃ 2 h以上處理時全部死亡，其余高溫處理下均能正常生長，說明雙斑長跗螢葉甲在極端高溫條件下，能迅速提高自身的耐熱能力，以適應(yīng)高溫環(huán)境。

昆蟲為維持其正常的生命活動，其血淋巴中的蛋白質(zhì)、游離氨基酸等重要代謝物必須維持在一個較為恒定的水平。外界脅迫，如高溫、低溫、真菌侵入[10]等都會導(dǎo)致免疫蛋白和防御酶類的合成，大量消耗了昆蟲體內(nèi)的游離氨基酸。由此推斷，在高溫條件下，雙斑長跗螢葉甲雌蟲體內(nèi)可能合成大量免疫蛋白和防御酶類，導(dǎo)致游離氨基酸含量大幅度下降。

糖類是昆蟲血淋巴的重要組分，是血淋巴貯存和運(yùn)輸能源物質(zhì)的重要形式。昆蟲血淋巴中最主要的糖類為海藻糖，占整個血淋巴中糖類含量的80%～90%[11]。海藻糖還能作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，以保護(hù)昆蟲躲避熱壓力等惡劣環(huán)境[12]，能夠在高溫、高寒、干燥失水等惡劣的條件下在細(xì)胞表面形成特殊的保護(hù)膜，有效地保護(hù)生物分子結(jié)構(gòu)不被破壞[11]。隨著溫度的升高（33～35℃），雙斑長跗螢葉甲成蟲體內(nèi)可溶性糖含量和海藻糖含量也隨之上升，這與西伯利亞蝗的研究結(jié)果類似[13]，進(jìn)一步說明雙斑長跗螢葉甲成蟲對短時高溫具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。

新疆屬高溫干旱地區(qū)，雙斑長跗螢葉甲成蟲發(fā)生期正處于新疆高溫時期，開展雙斑長跗螢葉甲雌蟲與短時高溫之間關(guān)系的研究具有現(xiàn)實(shí)和生態(tài)意義。根據(jù)不同溫度處理后雙斑長跗螢葉甲的可溶性糖、游離氨基酸和海藻糖的變化趨勢，綜合分析得出，雙斑長跗螢葉甲在33～41℃下，均能正常生長，而且體內(nèi)可溶性糖和海藻糖一直處于上升階段，而對45℃的高溫也有一定的適應(yīng)性。表明雙斑長跗螢葉甲在高溫脅迫下，通過不斷積累體內(nèi)抗逆物質(zhì)提高自身的耐熱能力。這也預(yù)示著在新疆氣候變暖趨勢下，雙斑長跗螢葉甲的發(fā)生仍會比較嚴(yán)重。本研究結(jié)果，為進(jìn)一步研究高溫對雙斑長跗螢葉甲影響的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）