百合細(xì)胞懸浮體系構(gòu)建及多糖含量測定的探索

張 帆，陳秋逸，尤玉玲，馬芃銳，趙 凱，鄭冬超

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065)

百合 (LiliumbrowniiF.E.Brownvar.viridulum Baker)多糖是從百合中提取的一類具有多種生物活性的化合物，其粗提物及純化物具有較為廣泛的藥理作用，主要包括抗氧化、抗腫瘤、降血糖與免疫調(diào)節(jié)等作用，因此百合多糖逐漸成為一種新興的生活保健藥品[1－3]。目前大多數(shù)的百合多糖從百合鱗莖中提取，這樣的獲取方法不但成本高而且生產(chǎn)周期長，難以滿足日益增長的生產(chǎn)需求[4－6]。同時其來源的缺乏也阻礙了關(guān)于百合多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究[4，6]，這也成為百合多糖化學(xué)合成的一個瓶頸，使得其各種藥理作用機(jī)制尚不明確。

植物細(xì)胞懸浮體系構(gòu)建的相關(guān)研究近年來已得到了廣泛的關(guān)注[7－9]，其中百合細(xì)胞懸浮體系的構(gòu)建已取得一些進(jìn)展[10－11]，然而利用百合細(xì)胞懸浮體系來生產(chǎn)百合多糖的相關(guān)報道很少。本項目計劃構(gòu)建起百合的細(xì)胞懸浮體系，然后通過激素調(diào)節(jié)來誘導(dǎo)其產(chǎn)生百合多糖，并對多糖含量進(jìn)行測定，找出誘導(dǎo)百合多糖生成的最佳激素配比，從而為百合多糖的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供新思路和理論指導(dǎo)。

1 實驗材料與步驟

1.1 實驗材料

本項目采用培育于四川大學(xué)生物實驗教學(xué)中心植物組培室的百合無菌組培苗為實驗材料。

百合組培苗的培育步驟如下:1)選取百合盆栽苗的子房、花柱作為外植體，先用流水沖洗30 min，加入少量洗潔精搖動洗滌10 min，再用流水沖洗1 h；2)然后轉(zhuǎn)至超凈工作臺中用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～4次；3)用10%次氯酸鈉搖動浸泡10 min，無菌水沖洗3～4次。4)將消毒好的材料用無菌濾紙吸干表面多余水分，用剪刀和解剖刀將子房或花柱剪切成1.5 cm左右的小段，將其接種于相同的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每培養(yǎng)基接種2～3個外植體，然后將其放置于組培室中進(jìn)行光照培養(yǎng)(分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS＋6－BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L＋瓊脂糖8 g/L＋蔗糖30 g/L，pH＝5.8)。5)在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)1月左右，外植體逐漸分化出芽，將其轉(zhuǎn)移至伸長培養(yǎng)基中(伸長培養(yǎng)基成分為MS＋6－BA 0.5 mg/L＋I(xiàn)BA 0.1 mg/L＋瓊脂糖8 g/L＋蔗糖30 g/L，pH＝5.8)。6)待莖芽伸長至2 cm左右時，再轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中 (生根培養(yǎng)基成分為1/2MS＋NAA 0.2 mg/L＋瓊脂糖8 g/L＋蔗糖20 g/L，pH＝5.8)。7)生根培養(yǎng)1～2月左右，可獲得完整的百合組培苗，將其擴(kuò)繁后以備后續(xù)實驗所用。

1.2 實驗步驟

1.2.1 百合愈傷組織的誘導(dǎo)

選取百合組培苗的葉片、葉柄和鱗莖作為外植體。葉片用剪刀在葉中間部位橫切至葉脈處；葉柄切成l～2 cm長的小段；鱗莖豎切成兩半。將處理后的材料置于含不同激素配比的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，如表1所示，避光培養(yǎng)。記錄初始愈傷組織產(chǎn)生時間，培育40 d后統(tǒng)計愈傷組織塊數(shù)，計算愈傷組織誘導(dǎo)率 (愈傷組織誘導(dǎo)率＝產(chǎn)生愈傷組織的外植體個數(shù)/接種外植體總數(shù) ×100%)[12－13]，記錄愈傷組織生長狀態(tài) (顏色、致密程度、生長速度、褐化程度等)。

表1 百合愈傷組織誘導(dǎo)實驗的不同激素配比(mg/L)

表1 (續(xù)表)

1.2.2 百合細(xì)胞懸浮體系的構(gòu)建

選取生長良好的百合愈傷組織，于超凈工作臺上將其盡量切碎后轉(zhuǎn)移至20 mL液體培養(yǎng)基中，置于150 rpm的搖床上黑暗振蕩培養(yǎng)，溫度為25℃。定期觀察其生長狀態(tài)，及時清理污染，每隔7～10 d對其進(jìn)行繼代培養(yǎng)。初始懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液配方為 MS＋6－BA 0.5 mg/L＋2，4－D 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋蔗糖30 g/L，pH＝5.8。1.2.3 不同激素處理百合細(xì)胞懸浮體系

百合懸浮細(xì)胞培育2周左右，待其生長狀態(tài)良好，濃度適宜時，對其進(jìn)行不同的激素組合處理如表2所示，每個處理重復(fù)4次，每隔7～10 d繼代。(mg/L)

表2 百合細(xì)胞懸浮體系激素處理組合

1.2.4 百合多糖的提取

激素處理20 d后，過濾收集各處理下的百合懸浮細(xì)胞樣品，記錄重量，研磨成粉末，置通風(fēng)處晾干，在水浴80℃下，加入15倍量水 (料液質(zhì)量比)提取2～3次，每次2 h，過濾，合并濾液和愈傷培養(yǎng)液，加熱濃縮，然后加入3倍濃縮液體積的95%(V/V)乙醇，置于4℃冰箱中過夜。待絮狀凝膠物和粒狀沉淀析出后，以3 000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀加適量45℃水溶解，加入3倍量95%乙醇，再經(jīng)靜置、離心、過濾后，依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，40～60℃干燥得百合多糖粗提物。多糖產(chǎn)品再用適量45℃蒸餾水定容，記錄體積、稀釋倍數(shù)，即為待測樣液。

1.2.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，蒸餾水溶解并定容至500 mL容量瓶中，即得0.04 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。吸取0.04 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6及1.8 mL，分別置于10 mL帶塞試管中，各以蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，再分別加6%苯酚試劑1.0 mL搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻冷卻，室溫放置20 min。另以蒸餾水2.0 mL，作為空白對照同上操作。于490 nm處測定吸光度值。同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測定3次。以多糖溶液濃度(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.6 百合多糖含量的測定

精密稱取2 mL百合多糖樣品溶液，加6%苯酚試劑1.0 mL搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻冷卻，室溫放置20 min。取蒸餾水(同1.2.5節(jié)處理)作為空白對照液，于490 nm處測吸光度值。從回歸方程中求出樣品溶液中的多糖濃度，然后再根據(jù)以下公式計算其多糖含量[14－16]。

多糖含量(%)＝(樣品液多糖濃度×樣品體積×稀釋倍數(shù)/樣品重)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比及外植體部位對百合愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響

為研究不同激素處理對百合愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響，統(tǒng)一采用百合組培苗的葉片為材料，設(shè)立了11個激素組合來進(jìn)行實驗 (見表1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在只添加NAA和6－BA的前9個激素組合里，激素組合2(6－BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L)相比其他8組愈傷組織形成最早，誘導(dǎo)效率最高，達(dá)到了35%，但總體來說這9個組合的誘導(dǎo)效率都不理想，且玻璃化及褐化現(xiàn)象較為嚴(yán)重。通過查閱資料，我們又增設(shè)了兩個激素組合，來探索采用3種植物激素2，4－D、NAA、6－BA協(xié)同處理對百合愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3種激素協(xié)同處理的組合10和組合11里，百合愈傷組織誘導(dǎo)效率均高于前9個組合，組合11(6－BA 0.5 mg/L＋2，4－D 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L) 的愈傷組織誘導(dǎo)效率要高于組合10，達(dá)到了60%，其愈傷組織形成較早，褐化及玻璃化程度也大大下降，愈傷組織呈淡黃或黃色，較疏松且生長速度快，如表3所示。因此，在本實驗所設(shè)條件下，6－BA 0.5 mg/L＋2，4－D 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L是誘導(dǎo)百合愈傷組織形成與生長的最佳激素組合。

表3 不同激素濃度對百合愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表3 (續(xù)表)

為了研究不同外植體對百合愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響，選取百合組培苗的葉片、葉柄、鱗莖3個部位來進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，選用統(tǒng)一的激素組合(6－BA 0.5 mg/L＋2，4－D 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L)進(jìn)行處理。培育40 d后觀察誘導(dǎo)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用鱗莖作為外植體愈傷組織形成時間最短，生長也較快，但是鱗莖愈傷組織極易分化形成氣生根，導(dǎo)致愈傷誘導(dǎo)率大幅下降；葉片的愈傷組織形成時間較長，且褐化情況嚴(yán)重，也易于玻璃化；葉柄的愈傷誘導(dǎo)率相對較高，愈傷組織成黃色或淡黃色，較疏松且生長快，其玻璃化及褐化程度也低于葉片和鱗莖，如圖2和表4所示。因此，綜合考慮下，百合組培苗的葉柄可以作為其愈傷組織誘導(dǎo)的一種較為理想的材料。

圖2 不同百合外植體取材部位的愈傷組織誘導(dǎo)效果

表4 不同百合外植體取材部位對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同激素處理對百合多糖含量的影響

百合懸浮細(xì)胞利用統(tǒng)一的激素組合 (6－BA 0.5 mg/L＋2，4－D 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L) 處理14 d后，其懸浮溶液中的細(xì)胞呈現(xiàn)出健康的淡黃色，顆粒均勻飽滿，生長狀態(tài)良好，細(xì)胞懸浮溶液濃度適中。再經(jīng)不同的激素配比處理20 d(見表2)，然后采用苯酚硫酸法測定各處理下懸浮細(xì)胞的百合多糖含量。結(jié)果顯示:在激素組合8的處理下，百合懸浮細(xì)胞生長速度較快，長勢良好，且百合多糖含量最高，達(dá)到了3.8%。因此，在本實驗所設(shè)的條件下，用于百合細(xì)胞懸浮體系構(gòu)建及誘導(dǎo)百合多糖生成的最佳激素組合為6－BA 1.0 mg/L＋2，4－D 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，如表5所示。

表5 不同激素處理下百合愈傷組織的多糖含量

3 結(jié)束語

為了研究百合細(xì)胞懸浮體系構(gòu)建及誘導(dǎo)百合多糖生成的最佳培養(yǎng)條件，我們以百合組培苗為材料，誘導(dǎo)其愈傷組織形成，進(jìn)而構(gòu)建起其細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，然后通過不同激素處理，誘導(dǎo)百合細(xì)胞懸浮體系產(chǎn)生百合多糖，并對各處理下的多糖含量進(jìn)行測定。

在百合愈傷組織誘導(dǎo)方面，我們發(fā)現(xiàn)相比只用6－BA和NAA處理，采用3種植物激素2，4－D、NAA、 6－BA協(xié)同處理 (6－BA 1.0 mg/L＋2，4－D 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L)可使得百合愈傷組織誘導(dǎo)率大大提高，褐化及玻璃化現(xiàn)象也得到大大緩解。這與前人的一些研究成果一致:2000年在文獻(xiàn)[17]的研究中證明3種植物激素2，4－D、NAA、6－BA協(xié)同處理要高于單種激素處理；2009年在文獻(xiàn) [18]研究中報道，只采用6－BA、NAA激素處理最適于百合的分化培養(yǎng)，而適當(dāng)添加高濃度2，4－D有利于愈傷組織的形成。另外發(fā)現(xiàn)，以百合組培苗的葉柄作為外植體，愈傷組織的生長狀態(tài)最好，誘導(dǎo)率最高。

在百合懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)百合多糖生產(chǎn)方面，發(fā)現(xiàn)在激素組合6－BA 1.0 mg/L＋2，4－D 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L的處理下，百合懸浮細(xì)胞生長速度較快，長勢良好，且百合多糖含量最高，達(dá)到了3.8%。百合多糖的提取從傳統(tǒng)的水提法、溶劑提取法，發(fā)展到超聲波輔助法、微波輔助法，其提取率得到了大大的提升。文獻(xiàn)[19]以新鮮蘭州百合為材料，采用優(yōu)化的水提法提取百合多糖，其百合粗多糖提取率為0.92%。文獻(xiàn) [20]以超聲波輔助法提取藥用百合干片中的百合多糖，提取率可達(dá)1.37%。文獻(xiàn)[21]以微波輔助法提取百合多糖，其提取率可達(dá)3.14%。文獻(xiàn)[22]以優(yōu)化條件的超聲波輔助法提取百合多糖，提取率可達(dá)7.92%。雖然本實驗所用樣品重量為濕重而非干重，這會影響數(shù)據(jù)結(jié)果，但總體來說本實驗百合多糖的提取率仍然不夠理想，還需要我們后期再采用更為先進(jìn)的提取工藝，設(shè)立更多的激素處理，找出更適宜誘導(dǎo)百合多糖生成的激素配比。

本研究從百合組培苗的培育、愈傷組織的誘導(dǎo)、細(xì)胞懸浮體系的構(gòu)建，到百合多糖的提取和含量測定，做出了一條完整的生產(chǎn)百合多糖的路線，找出了在實驗所設(shè)條件下，百合懸浮細(xì)胞體系構(gòu)建及誘導(dǎo)百合多糖產(chǎn)生的最適宜培養(yǎng)條件，在實驗室階段驗證了該實驗方案的可行性。本研究對實現(xiàn)百合多糖的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

[1]苗明三.百合多糖抗氧化作用研究[J].中藥藥理與臨床，2001，17(2):12－13.

[2]劉成梅，付桂明，涂宗財，等.百合多糖降血糖功能研究[J].食品科學(xué)，2002，23(6):113－114.

[3]李利華.百合多糖的含量測定及抗氧化活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50(14):2954－2957.

[4]趙國華，李志孝，陳宗道，等.百合多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2002，21(1):62－66.

[5]馬君義，趙小亮，張繼，等.蘭州百合的研究進(jìn)展[J].塔里木大學(xué)學(xué)報，2005，17(4):53－56.

[6]任利君，劉俊田，彌曼，等.百合多糖的研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2005，20(6):284－285.

[7]王艷紅，龔束芳，車代弟，等.豐花月季愈傷組織的誘導(dǎo)及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，38(2):161－165.

[8]陳文源，呂一婷.藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與新藥研發(fā)進(jìn)展(綜述)[J].亞熱帶植物科學(xué)，2009，38(4):85－88.

[9]馮玥，習(xí)洋，陳串，等.刺槐胚性細(xì)胞懸浮體系的建立[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，42(12):80－84.

[10]姜新超.百合懸浮細(xì)胞體系的建立及植株再生[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

[11]權(quán)永輝.百合體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)及懸浮培養(yǎng)的研究[D].陜西:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[12]王紀(jì)，謝寅峰，方升佐.青錢柳愈傷組織誘導(dǎo)與增殖的初步研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(3):1309－1312.

[13]胡選萍.不同因素對魔芋愈傷組織誘導(dǎo)及增殖分化的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53(21):5288－5291.

[14]楊林莎，李玉賢，李明麗，等.苯酚－硫酸比色法測定百合多糖的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(8):704－705.

[15]楊林莎，李玉賢，李秋杰，等.百合多糖提取、純化工藝優(yōu)選[J].中醫(yī)研究，2005，18(1):25－27.

[16]李霞，張峰，李永才，等.蘭州百合不同部位多糖含量及抗氧化活性的比較[J].食品工業(yè)科技，2012，33(24):88－91.

[17]孫君社，方曉華.植物激素對百合鱗片愈傷組織生長的影響[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，6(6):58－61.

[18]李筱帆.幾種百合組織培養(yǎng)及體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)的研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué)，2009.

[19]熊明郁，牛世全.水提法提取百合多糖優(yōu)選工藝的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(36):13047－13049，13065.

[20]禹文峰，任鳳蓮，吳曉斌.百合多糖的超聲波提取工藝研究[J].廣州化學(xué)，2007，32(2):36－40.

[21]羅金花.微波輔助萃取百合多糖的工藝研究[J].宜春學(xué)院學(xué)報，2008，30(4):25－26.

[22]楊朝霞，段美香，佘高照，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化百合多糖超聲提取工藝研究[J].廣州化工，2013，41(18):52－55.