桂枝茯苓膠囊抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠子宮內(nèi)膜血管新生

劉明星 許 越 蔣亞玲 歐妙嫻

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510150)

子宮內(nèi)膜異位癥(EM) 是具有生長(zhǎng)功能的內(nèi)膜細(xì)胞在子宮腔內(nèi)膜以外位置異位生長(zhǎng)而形成的一種女性常見(jiàn)婦科疾病〔1，2〕。雖然目前EM的發(fā)病機(jī)制仍未闡明，EM發(fā)生發(fā)展有賴(lài)于血管生成和充足的血液供應(yīng)，抗血管生成治療法已成為治療研究的新熱點(diǎn)〔2，3〕?！督饏T要略》指出桂枝茯苓具有活血化瘀之功效，用于婦女血瘀、經(jīng)閉及惡露等頑疾。本研究觀察caveolin-1的表達(dá)，探討桂枝茯苓膠囊對(duì)EM大鼠治療效果和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性、性成熟SD大鼠80只，體重200～220 g，清潔級(jí)，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)室溫20℃～25℃，相對(duì)濕度50%～70%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水飲食，每日觀察動(dòng)物進(jìn)食情況，稱(chēng)體重，及時(shí)清理糞便。

1.2構(gòu)建EM大鼠模型〔4〕篩選處于動(dòng)情期大鼠(經(jīng)陰道涂片檢查)，在造模前夜所有大鼠予以禁食，不禁水，術(shù)前對(duì)大鼠予以腹腔注射2%戊巴比妥鈉實(shí)施麻醉(120 mg/kg)，固定大鼠手術(shù)臺(tái)。取腹正中、恥骨聯(lián)合上2 cm切長(zhǎng)2～3 cm切口進(jìn)腹，取近端離右側(cè)子宮角1 cm處結(jié)扎，遠(yuǎn)端離卵巢1 cm處結(jié)扎后切下大鼠子宮，置入無(wú)菌生理鹽水培養(yǎng)皿中，縱向剖開(kāi)大鼠子宮分離，取組織剪剪取3塊3 mm×5 mm的子宮內(nèi)膜組織備用。在腹壁切口右側(cè)從腹肌與皮下筋膜層之間剝離，置入子宮內(nèi)膜片，取1塊子宮內(nèi)膜組織平整置于剝離處底部，動(dòng)態(tài)觀察，4 w后模型復(fù)制成功。

1.3分組處理 將造模成功的大鼠分為模型對(duì)照組、桂枝茯苓膠囊低、高劑量組各20只。桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組分別采用0.5、1.5 g/kg桂枝茯苓膠囊進(jìn)行灌胃治療；空白對(duì)照組和模型對(duì)照組則以等量生理鹽水灌胃。1次/d，連續(xù)28 d，結(jié)束治療后，處死大鼠，摘取異位子宮內(nèi)膜，將每個(gè)標(biāo)本切為4份，分別用于免疫組織化學(xué)和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)。

1.4免疫組織化學(xué)染色與觀察 將組織切片至于68℃烤箱30 min，然后進(jìn)行二甲苯脫蠟處理，梯度酒精脫水：二甲苯孵育5 min，棄去二甲苯，加入新的二甲苯繼續(xù)孵育5 min，無(wú)水乙醇洗滌3 min，無(wú)水乙醇Ⅱ洗滌3 min，分別95%、80%乙醇洗滌3 min，而后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min；以檸檬酸鈉為修復(fù)液，在高壓鍋內(nèi)置入載有玻片的盒子進(jìn)行熱修復(fù)，加熱至沸騰煮5 min后，停止加熱，冷卻至室溫；再予以甲醇-H2O2溶液避光修復(fù)15 min，以阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶對(duì)標(biāo)本的破壞，PBS洗滌3次，每次3 min；按照1∶500的比例加入caveolin-1抗體，對(duì)石蠟組織切片進(jìn)行室溫孵育1 h或者4℃孵育過(guò)夜，之后用PBS沖洗3次，每次3 min；按照1∶1 000的比例加入辣根過(guò)氧化物(HRP)二抗，對(duì)石蠟組織切片進(jìn)行室溫孵育40 min，之后用PBS沖洗3次，每次3 min；加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒中的顯色劑，室溫孵育5～10 min，然后清水沖洗；再進(jìn)行蘇木精復(fù)染室溫孵育3～5 min，清水沖洗；對(duì)染色后的切片進(jìn)行梯度酒精水化處理，然后樹(shù)膠封片觀察。采用上述同樣的操作方法，對(duì)組織切片中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察。

1.5熒光定量PCR檢測(cè) 取各組的組織切片，采用RNA提取試劑盒對(duì)各組織切片的RNA進(jìn)行提取，所有操作嚴(yán)格按照提取試劑盒(天根生化科技有限公司)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將提取得到的RNA進(jìn)行體外反轉(zhuǎn)錄，采用miScript Ⅱ RT試劑盒(Qiagen公司)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄完成后，將反應(yīng)液至于-20℃冰箱，以備下步定量PCR實(shí)驗(yàn)；以U6為內(nèi)參，對(duì)組織中caveolin-1及VEGF的表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR操作，反應(yīng)條件如下，預(yù)變性：95℃ 30 s，擴(kuò)增(40個(gè)循環(huán))：94℃ 30 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s，引物序列caveolin-1上游GGATGAGGATCACTGTTTTG、下游CCATTTGTCCACTGTAATT；VEGF上游AGAGGAAAGAGGTAGCAG、下游CCCAAAAGCAGGTCAGTC；β-actin上游ACCCGCGAGTACAACCTT、下游CATACCCACCATCACACC。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析，Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1caveolin-1、VEGF蛋白表達(dá)染色結(jié)果比較 caveolin-1蛋白主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，模型對(duì)照組caveolin-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少，28 d治療后，桂枝茯苓膠囊低、高劑量組caveolin-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加；VEGF在模型對(duì)照組中高表達(dá)，細(xì)胞陽(yáng)性率較高，而桂枝茯苓膠囊低、高劑量組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，見(jiàn)圖1。

圖1 各組caveolin-1、VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)

2.2caveolin-1表達(dá)定量比較 治療前模型對(duì)照組caveolin-1表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(t=13.89，P<0.05)，而與桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.456，P>0.05)；空白對(duì)照組及模型對(duì)照組治療前后caveolin-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而桂枝茯苓膠囊低、高劑量組治療后caveolin-1的表達(dá)較治療前顯著升高(P<0.001)，相比于模型對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中桂枝茯苓膠囊高劑量組caveolin-1的表達(dá)水平顯著高于低劑量組(t=9.269，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組治療前后caveolin-1、VEGF相對(duì)表達(dá)比較

與模型對(duì)照組比較:1)P<0.05；與空白對(duì)照組比較：2)P<0.05；與桂枝茯苓膠囊低劑量組比較：3)P<0.05

2.3VEGF表達(dá)定量比較 治療前模型對(duì)照組VEGF的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(t=14.84，P<0.05)，而與桂枝茯苓膠囊低、高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.014，P>0.05)；空白對(duì)照組及模型對(duì)照組治療前后、VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而桂枝茯苓膠囊低、高劑量組治療后、VEGF表達(dá)較治療前顯著下降(P<0.001)，其中桂枝茯苓膠囊中高劑量組VEGF表達(dá)水平顯著低于低劑量組(t=3.141，P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4caveolin-1與VEGF表達(dá)相關(guān)性 caveolin-1與VEGF表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r低劑量組=-0.65，P<0.05；r高劑量組=-0.61，P<0.05)，隨著caveolin-1表達(dá)水平的提高，VEGF的表達(dá)逐漸降低，見(jiàn)圖2。

圖2 桂枝茯苓膠囊低、高劑量組caveolin-1與VEGF的表達(dá)相關(guān)性

3 討 論

EM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中新生血管的形成不僅能為異位病灶提供充足的氧氣，還可以維持其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，因而血管生成是異位病灶形成的重要條件〔5〕。血管生成是指從機(jī)體已存在的血管組織上產(chǎn)生新血管的動(dòng)態(tài)過(guò)程，其中涉及多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子參與調(diào)控，主要過(guò)程包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及分化過(guò)程等〔6，7〕。caveolin-1是內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)源性蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)量較高，其在血管生成中的作用得到了廣泛的研究〔8，9〕。細(xì)胞周期分析證實(shí)高表達(dá)caveolin-1可以抑制VEGF引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究顯示caveolin-1與腫瘤及血管生成關(guān)系密切〔10〕。與野生型鼠相比，caveolin-1基因敲除鼠腫瘤血管通透性、腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)均增加〔9〕。這可能與在caveolin-1基因敲除鼠模型中，VEGF受體2磷酸化水平和內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(NO)合成酶(eNOS)活性升高有關(guān)〔10〕。在內(nèi)皮細(xì)胞遷移過(guò)程中，caveolin-1也起著重要作用，當(dāng)其表達(dá)水平下調(diào)后，內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)受到抑制，可見(jiàn)caveolin-1可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移〔10，11〕。內(nèi)皮細(xì)胞在生長(zhǎng)未達(dá)到接觸抑制前，caveolin-1可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，且caveolin-1表達(dá)在血管生成刺激因子作用下降低；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到接觸抑制狀態(tài)時(shí)，caveolin-1表達(dá)不受血管生成刺激因子作用的影響〔9〕。其中VEGF最為關(guān)鍵〔11〕，EM患者腹腔液中VEGF 的含量顯著高于正常婦女〔12〕。且EM嚴(yán)重程度與腹腔液中VEGF含量呈正相關(guān)〔13〕。

本研究表明EM大鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1與VEGF可能通過(guò)其相互作用，參與子宮內(nèi)膜血管新生的過(guò)程，這與文獻(xiàn)報(bào)道〔14〕也較為一致。

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