中風回語顆粒對腦缺血再灌注損傷小鼠的影響及機制

俞之胤 韓 冬 李 娜 李曉華 石曉征 闞 默 修凡懿 王 健

(長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117)

腦血管疾病為臨床常見病，以缺血性腦血管病最為普遍，在治療過程中首先應該恢復缺血區(qū)的血流供應，但是，同時又會造成腦缺血再灌注損傷〔1,2〕。中風回語顆粒是臨床經(jīng)驗方，作為院內(nèi)制劑應用多年，由石昌蒲、郁金、黃連、冰片、川芍等10味中藥組成，具有化痰宣竅，清熱化癖，透腦清神等功效，用于缺血性腦卒中的治療〔3〕。本研究觀察中風回語顆粒對缺血再灌注引起腦組織損傷的影響及機制。

1 材料與方法

1.1動物 成年昆明種小鼠，雄性，體重22～26 g，清潔級，由吉林大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK-(吉)2011-0003。小鼠在SPF級實驗室條件下飼養(yǎng)，所有小鼠自由攝食及飲水。

1.2藥品與試劑 鹽酸美金剛片(丹麥靈北藥廠)；中風回語顆粒顆粒(長春中醫(yī)藥大學研發(fā)中心)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測試盒、一氧化氮(NO)測試盒、一氧化氮合酶(NOS)、T-ATPase試劑盒、Na+-K+-ATPase試劑盒、Ca2+-Mg2+-ATPase試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3動物分組及小鼠腦缺血再灌注損傷模型建立 120只小鼠隨機分為：假手術組(n=20)、模型組(n=20)、中風回語顆粒低劑量組(n=20)、中風回語顆粒中劑量組(n=20)、中風回語顆粒高劑量組(n=20)及鹽酸美金剛組(n=20)。中風回語顆粒低、中、高劑量組分別按劑量體重比1.2 g/kg，2.4 g/kg，4.8 g/kg灌胃中風回語顆粒溶液，鹽酸美金剛組按劑量體重比3 mg/kg灌胃鹽酸美金剛片溶液。用羧甲基纖維素鈉溶液稀釋所有小鼠灌胃藥物，假手術組及模型組按體重給予等體積羧甲基纖維素鈉溶液，各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥后30 min，所有小鼠用水合氯醛(3.5%)腹腔注射麻醉，按文獻方法〔4,5〕制備小鼠腦缺血再灌注模型，從胸骨柄到下領骨切口，分離左側(cè)頸總動脈，頸外動脈及頸內(nèi)動脈。用動脈夾暫時夾閉頸內(nèi)、頸總動脈，在頸外動脈上切口，將栓線插入，并打一個松結(jié)，然后松開動脈夾，繼續(xù)插入栓線，當栓線遇到輕微阻力，停止插入，表明成功阻斷大腦中動脈，計時，1 h后，拔出線栓，進行再灌注，計時，24 h后，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術組小鼠只進行手術，不實施缺血再灌注操作。

1.4實驗方法與觀察指標 (1)神經(jīng)行為學評分：各組隨機選取10只小鼠，觀察存活小鼠行為變化，參考Wayne Clark評分(0～28分)〔6〕，主要觀察小鼠的身體對稱性(0～4分)；步態(tài)(0～4分)；攀爬(45°粗糙平面，0～4分)； 轉(zhuǎn)圈實驗 (在實驗臺表面，0～4分)；前肢對稱性(小鼠從尾部懸起，0～4分)；強迫轉(zhuǎn)圈(前肢著于平面，提尾使后肢懸空，0～4分)；胡須反應性(從后部輕觸)。(2)各組剩余的10只小鼠頸椎脫臼處死，取腦缺血側(cè)腦組織，通過生理鹽水制成10%的腦組織勻漿，離心(4 000 r/min，10 min)后取上清，依次按GSH-PX試劑盒、SOD試劑盒、NOS試劑盒、T-ATPase試劑盒、Na+-K+-ATPase試劑盒 、Ca2+-Mg2+-ATPase試劑盒、MDA試劑盒、NO試劑盒方法，測定GSH-PX，SOD，NOS，T-ATPase、Na+-K+-ATPase 、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性和MDA、NO含量〔7,8〕。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能評分比較 假手術組(0.00±0.00)分未見明顯神經(jīng)功能損害。與假手術組比較，模型組(24.18±3.66)分神經(jīng)功能評分顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸美金剛組及中風回語顆粒中、高劑量組小鼠神經(jīng)功能評分〔(14.56±2.08)分、(19.65±2.96)分、(18.92±2.65)分〕顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。低劑量組神經(jīng)功能評分(21.21±4.38)分與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2各組腦組織MDA含量及SOD、GSH-Px活性比較 與假手術組比較，模型組腦組織MDA含量明顯增加，而SOD、GSH-Px活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與模型組比較，鹽酸美金剛組及中風回語顆粒中、高劑量組MDA含量明顯降低，而SOD、GSH-Px活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.3各組NO含量及NOS活性比較 與假手術組比較，模型組NO含量及NOS活性均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與模型組比較，鹽酸美金剛組及中風回語顆粒中、高劑量組NO含量及NOS活性均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.4各組T-ATPase、Na+-K+-ATPase 、Ca2+-Mg2+-ATPase活性比較 與假手術組比較，模型組T-ATPase、Na+-K+-ATPase 、Ca2+-Mg2+-ATPase活性均明顯降低(均P<0.05)。與模型組比較，鹽酸美金剛組及中風回語顆粒中、高劑量組T-ATPase、Na+-K+-ATPase 、Ca2+-Mg2+-ATPase活性均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1 各組MDA、NO含量及SOD、GSH-Px、NOS活性比較

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2 各組T-ATPase、Na+-K+-ATPase 、Ca2+-Mg2+-ATPase活性比較

3 討 論

本研究結(jié)果表明中風回語顆粒能夠改善腦缺血再灌注損傷小鼠運動功能〔9〕。腦缺血時，腦組織內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，但機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)并不能同時提供，特別是在再灌注發(fā)生的時候，腦組織損傷進一步加重。MDA是不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，能夠反映脂質(zhì)過氧化程度〔10～12〕。腦缺血發(fā)生時，自由基生成顯著增加，體內(nèi)抗氧化物質(zhì)被過度消耗，此時，SOD，GSH-Px活性表現(xiàn)為顯著下降。因此，機體清除氧自由基的能力通常用GSH-Px，SOD的活性來表示〔13～15〕。本研究結(jié)果提示中風回語顆粒能提高腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織中抗氧化活性。

NO即是一種新型信使，也是一種自由基。已有文獻報道，NO參與了腦缺血再灌注性損傷的諸多環(huán)節(jié)〔16〕。NO具有雙重作用，一方面能夠擴張腦血管，改善腦部循環(huán)，另外一方面可以抑制線粒體呼吸及過氧化膜脂質(zhì)等作用引起神經(jīng)元的損傷。本研究結(jié)果提示中風回語顆粒能減輕腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織NO的損傷。

Na+-K+-ATPase的主要功能是平衡細胞內(nèi)外Na+，K+濃度，而Ca2+-Mg2+-ATPase的主要功能是維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)。細胞ATP酶活性的改變是腦缺血再灌注后是神經(jīng)質(zhì)膜損害的明顯標志，也是引起缺血后神經(jīng)元過度損傷的重要因素。當腦缺血再灌注損傷發(fā)生時，能量耗竭，ATP酶活性下降，Na+-K+-ATPase活力下降導致細胞內(nèi)Na+增高，胞內(nèi)Na+增多引起Na+、Ca2+交換增加，進一步加劇細胞內(nèi)Ca2+超載，引起遲發(fā)性細胞損傷〔17〕。本研究結(jié)果提示中風回語顆粒能夠明顯改善小鼠腦缺血時的耗竭狀態(tài)，避免進一步加重再灌注引起的細胞內(nèi)Ca2+超載，有利于緩解腦水腫，減輕神經(jīng)元損傷，發(fā)揮其對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織的保護作用。

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