miR-204在胃癌組織中的表達(dá)及對胃癌細(xì)胞凋亡的影響

陳 曦

(煙臺市萊陽中心醫(yī)院消化科，山東 煙臺 265200)

據(jù)報(bào)道，我國胃癌的發(fā)病率和死亡率均居于世界前列〔1〕。目前胃癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但已發(fā)現(xiàn)其與地域環(huán)境、飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣、幽門螺桿菌感染、癌前病變、遺傳、基因等有關(guān)〔2〕。微小RNA(miRNA)是一種廣泛存在于真核生物中的RNA分子，可以介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中的RNA沉默復(fù)合物形成，降解細(xì)胞質(zhì)中信使RNA，在轉(zhuǎn)錄后可對下游基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，miRNA的表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔3〕。miRNA-204(miR-204)位于人類第9號染色體上，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miR-204在結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，可能參與了腫瘤的發(fā)展，但對于miR-204調(diào)控腫瘤發(fā)展的具體作用機(jī)制目前尚無定論〔4,5〕。本研究旨在探討miR-204在胃癌組織中的表達(dá)及對胃癌細(xì)胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年6月至2017年3月在萊陽中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的胃癌患者53例，收集其手術(shù)切除的胃癌組織作為胃癌組標(biāo)本，并收集其癌旁(3 cm)正常組織作為對照組標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):①均經(jīng)病理組織學(xué)確診患有胃癌；②預(yù)計(jì)生存期超過3個(gè)月；③未接受過放化療治療者；④患者及其家屬對本次研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他惡性腫瘤者；②臨床病歷資料不全者；③胃癌復(fù)發(fā)者。53例患者中男29例，女24例，年齡50～76歲，平均(67.4±5.7)歲，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期17例，分化程度：中高分化25例，低分化28例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株(BGC823、SGC7901)購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，永生化胃上皮細(xì)胞株(GES-1)購自上海細(xì)胞研究所。采用維森特生物技術(shù)(中國)有限公司生產(chǎn)的RPMI-1640培養(yǎng)基(含10% 小牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 mg/ml)作為細(xì)胞培養(yǎng)液，將其置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(ThrmoFisher公司)中培養(yǎng)，溫度37℃，每2 d更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 采用Trizol試劑提取胃癌組標(biāo)本、對照組標(biāo)本、BGC823、SGC7901、GES-1細(xì)胞株中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列由Invitrogen公司設(shè)計(jì)，具體如下：miR-204上游引物：5'-AACCUGAUCCCGUCUGAGAUUG-3'，下游引物：5'-CCGGAUCAAGAUUAGUUCGGUU-3'。以β-actin為內(nèi)參，β-actin上游引物：5'-AGCGGGTCTGACGTAAAGCGA-3'，下游引物：5'-GTGGACGGGAGAGGAC-TGG-3'。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s，然后50個(gè)循環(huán):95℃ 10 s，65℃ 8 s，60℃延伸8 s。根據(jù)擴(kuò)增曲線確定Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-204的相對表達(dá)量。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將miR-204加入至無RNA酶水(RNase-free水)，配成20 μmol/L的溶液。收集對數(shù)期的 BGC-823、SGC-7901細(xì)胞，胰酶消化后用培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)，以2×105/ml 的細(xì)胞濃度接種于6孔板。加入lipo2000轉(zhuǎn)染試劑，Opti-MEM稀釋，靜置5 min。將混合液滴加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔500 μl，4～6 h后換液。轉(zhuǎn)染完成后加入4 μl的5-Fu溶液(50 ng/μl)，靜置24 h，消化細(xì)胞。

1.5細(xì)胞增殖檢測 采用四甲基耦氮唑鹽法(MTS)檢測轉(zhuǎn)染miR-204和未轉(zhuǎn)染miR-204人胃癌細(xì)胞株的增殖情況。消化并打勻各組貼壁細(xì)胞，將其移入96孔板中，每孔加入20 μl反應(yīng)溶液，CO2恒溫培養(yǎng)箱2 h，溫度37℃。使用自動酶標(biāo)儀(美國biotek公司)在490 nm波長處檢測各組的吸光度。

1.6細(xì)胞凋亡檢測 將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，在1 000 r/min離心10 min，舍去上清液，加入1 ml PBS緩沖液，輕微振蕩，1 000 r/min，在4℃下3 000 r/min離心10 min，舍去上清液，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，試劑盒購于上海前塵生物科技有限公司，所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用Modifit 1.0軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組標(biāo)本、對照組標(biāo)本、BGC823、SGC7901、GES-1細(xì)胞株中的miR-204表達(dá) 胃癌組標(biāo)本為(1.91±0.81)，對照組標(biāo)本為(3.87±1.36)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.014，P=0.000)。BGC823細(xì)胞株和SGC7901細(xì)胞株中的miR-204的相對表達(dá)量分別為(1.86±0.23)、(1.16±0.11)，均低于GES-1細(xì)胞株中的(5.27±0.64)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-36.504，-46.076；P=0.000，0.000)。

2.2胃癌組組織miR-204相對表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 胃癌組組織標(biāo)本中miR-204相對表達(dá)量與患者的年齡、性別無關(guān)(P>0.05)，而與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)(P<0.05)，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化組的miR-204相對表達(dá)量明顯低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化組的相對表達(dá)量(P<0.05)。見表1。

表1 胃癌組織miR-204相對表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3miR-204對細(xì)胞增殖的影響 第1天，未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染miR-204組BGC823、SGC7901細(xì)胞株的吸光度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第3天，未轉(zhuǎn)染組BGC823、SGC7901細(xì)胞株的吸光度高于轉(zhuǎn)染miR-204組(P<0.05)。見表2。

表2 miR-204對細(xì)胞增殖的影響

2.4miR-204對細(xì)胞凋亡的影響 BGC823未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡百分比為(8.26±0.38)%，低于轉(zhuǎn)染miR-204組的(9.14±0.26)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.044，P=0.000)；SGC7901未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡百分比為(4.13±0.28)%，低于轉(zhuǎn)染miR-204組 的(6.58±0.31)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.044，P=0.000)。

3 討 論

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，男性患者多于女性，在所有因惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的患者中，男性胃癌患者的死亡率排在第三位，僅次于肺癌和肝癌，而女性胃癌患者的死亡率排在第二位，僅次于肺癌〔6〕。研究胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的機(jī)制，對更好地預(yù)防和治療胃癌具有重要的臨床價(jià)值。已有研究報(bào)道探討胃癌的發(fā)病機(jī)制，但目前尚無統(tǒng)一定論，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為胃癌的發(fā)病機(jī)制與B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、幽門螺桿菌感染、miRNA等有關(guān)〔7〕。miRNA是由特殊的小型非編碼RNA組成RNA分子，這類RNA分子能夠識別指定的目標(biāo)mRNA，在轉(zhuǎn)錄后能抑制靶mRNA的翻譯過程并促進(jìn)其降解，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與其密切相關(guān)。嚴(yán)玉蘭等〔8〕的研究指出，miRNA-143在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平明顯較癌旁組織降低，且miRNA-143的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。郭曉東等〔9〕研究了miRNA-125在肝癌中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌組織中的miRNA-125含量明顯低于正常肝組織。由此可見miRNA家族中多個(gè)成員與惡性腫瘤關(guān)系密切。miR-204是miRNA家族中的一員，近年來有研究指出其在肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)，并且能對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡產(chǎn)生一定的影響〔10〕。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-204的相對表達(dá)量低于癌旁正常組織，人胃癌細(xì)胞株中miR-204的相對表達(dá)量低于永生化胃上皮細(xì)胞株，這提示miR-204在胃癌組織或胃癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)低表達(dá)，miR-204的表達(dá)水平可能會影響惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，胃癌組組織標(biāo)本中miR-204相對表達(dá)量與患者的年齡、性別無關(guān)，miR-204在TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化中的相對表達(dá)量明顯低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化中的相對表達(dá)，這提示胃癌組組織標(biāo)本中miR-204的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分化程度有關(guān)。Sacconi等〔11〕的研究顯示，胃癌患者血清中miR-204表達(dá)量顯著低于健康對照組，且胃癌患者在經(jīng)過手術(shù)治療后血清miR-204表達(dá)量顯著上調(diào)，且患者血清miR-204表達(dá)量與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度以及預(yù)后顯著相關(guān)，這與本研結(jié)果類似，并且提示miR-204可作為衡量胃癌嚴(yán)重程度的血清學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果還顯示，第3天未轉(zhuǎn)染組BGC823、SGC7901細(xì)胞株的吸光度高于轉(zhuǎn)染miR-204組，未轉(zhuǎn)染組BGC823、SGC7901細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡百分比顯著低于轉(zhuǎn)染miR-204組，這說明轉(zhuǎn)染miR-204后可抑制胃癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖，并能促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。miR-204對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控是多方面途徑共同作用的結(jié)果，Wu等〔12〕的研究結(jié)果顯示，miR-204能下調(diào)SOX4基因的表達(dá)，SOX4基因在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，能對腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖、凋亡進(jìn)行調(diào)控，因此這可能是miR-204影響腫瘤發(fā)展的途徑之一。李擴(kuò)等〔13〕的研究顯示，miR-204在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且miR-204與 Bcl-2蛋白、組蛋白脫乙酰酶1(Sirt1)蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，因此推測miR-204可能通過抑制Bcl-2蛋白、Sirt1蛋白的表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡，這也可能是miR-204對胃癌細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控的途徑之一。周保貞等〔14〕的研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌感染的患者血清miR-204的水平顯著降低，提示miR-204與幽門螺桿菌感染也存在一定關(guān)系，但具體作用機(jī)制尚不明確?？梢酝茰ymiR-204與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討。

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