槲皮素對氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

李海禹，孟哲，王琛，師強偉

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南 鄭州 450000）

動脈管壁內(nèi)的長期慢性炎癥反應(yīng)是促進粥樣硬化的疾病發(fā)展過程的重要致病因素之一[1]。Toll受體家族（TLRs）是一組病原分子模式識別受體，與內(nèi)毒素（LPS）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）和熱休克蛋白等內(nèi)源性及外源性致炎物質(zhì)結(jié)合，通過激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB等核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1和腫瘤壞死因子（TNF）-α等多種炎癥因子的表達(dá)，從而促進炎癥反應(yīng)過程。Toll受體4（TLR4）是被廣泛關(guān)注的TLRs成員之一，在調(diào)節(jié)天然免疫和觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)方面具有舉足輕重的作用[2]。研究表明[3]：抑制TLR4的過度激活可能是冠心病藥物治療的靶點。同時，槲皮素具有抗炎、抗腫瘤及抗氧化等多種生物活性作用。本實驗旨在觀察：槲皮素對抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌的炎癥反應(yīng)的細(xì)胞學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

DMEM高糖培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；胎牛血清及real-time RT-PCR試劑盒（北京TransGen公司）；ox-LDL購于廣東頤圓生物有限公司；槲皮素、青霉素、二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）、鏈霉素和噻唑藍(lán)（MTT）（美國sigma公司）；MCP-1和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（美國R&D systems公司）；兔抗大鼠TLR4、髓樣分化因子88（Myd88）、NF-κB（p65）、anti-TLR4及β-actin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

分離8～10周SD大鼠胸主動脈，仔細(xì)剝離血管內(nèi)膜及外膜，剪碎至1～2 mm3大小組織塊，使用貼壁法培養(yǎng)。將細(xì)胞置于含12%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，其中含有100 U/mL濃度的青霉素和100 μg/mL濃度的鏈霉素，然后放入37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合至80%～90%時，用于以下實驗。

1.3 實驗分組

將細(xì)胞分為5組：A組（對照組）、B組（ox-LDL干預(yù)組）、C組（ox-LDL＋槲皮素50 μmol/L）、D組（ox-LDL＋ 槲 皮 素100 μmol/L） 和 E組（ox-LDL＋ 槲 皮 素200 μmol/L）。B～D組中ox-LDL的濃度均為100 μg/mL。

1.4 方法

1.4.1 將細(xì)胞按4×104/孔的密度接種于96孔板，按照前述細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h備用，①應(yīng)用MTT比色法測定不同濃度槲皮素的細(xì)胞毒性時，改用2%低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后， 給予不同濃度槲皮素和ox-LDL（100 μg/mL）濃度干預(yù)24 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h，棄去上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，微微振蕩數(shù)次后，在全自動酶標(biāo)儀上于570 nm處測定各組吸光值。②應(yīng)用ELISA測定上清液中TNF-α和IL-1β的分泌時，換用無血清培養(yǎng)基孵育12 h。不同濃度槲皮素或anti-TLR4抗體及PDTC預(yù)處理1 h，再使用ox-LDL（100 μg/mL）刺激不同時間后，收集各組細(xì)胞上清液。依據(jù)操作說明，使用ELISA試劑盒測定MCP-1和TNF-α的分泌。使用自動酶聯(lián)免疫吸附儀在450 nm處讀取數(shù)值，繪制MCP-1和TNF-α的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并依據(jù)此計算各實驗組結(jié)果。

1.4.2 將各組細(xì)胞以5×105/孔的密度接種于6孔板中，加入含血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%融合時備用。①應(yīng)用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）測定TLR4和Myd88 mRNA表達(dá)時改用無血清培養(yǎng)基孵育12 h。換用不同濃度槲皮素預(yù)處理1 h，再給與100 μg/mL的ox-LDL刺激6 h，按照說明書使用Trizol（北京Transgen公司）提取各組總RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，分光光度計在260 nm處檢測RNA的純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京Transgen公司）操作步驟，將各組mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Bio-Rad IQ5熒光PCR儀自帶分析軟件對real-time PCR結(jié)果進行分析。②應(yīng)用Western-blot檢測TLR4、Myd88和NF-κB（p65）蛋白表達(dá)時，改用無血清培養(yǎng)基孵育12 h。換用含不同濃度槲皮素?zé)o血清培養(yǎng)基孵育 1 h后，加入 ox-LDL（100 μg/mL）刺激 24 h。每孔使用200 μL RIPA裂解液提取蛋白。核內(nèi)NF-κB（p65）蛋白使用核蛋白提取試劑盒提取。BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣品蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液并煮沸后，制作10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠進行電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。一抗?jié)?度 為 ：TLR4（1 ∶ 200）、Myd88（1 ∶ 400）、NF-κB（p65）（1∶ 500）和 β-actin（1∶ 2000）。以 β-actin作為內(nèi)參照?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測，圖像采集，Quantity one軟件進行圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度槲皮素細(xì)胞毒性測定

使用MTT法對不同濃度槲皮素干預(yù)的各組細(xì)胞進行測定后，在0～200 μmol/L濃度范圍內(nèi)，槲皮素均未顯示明顯的細(xì)胞毒性；僅給予細(xì)胞100 μg/mL ox-LDL孵育24 h后，也未出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒性。因此，在后續(xù)的試驗中，選取50，100，200 μmol/L 3個濃度進行干預(yù)處理。結(jié)果如圖1所示。

2.2 槲皮素對ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）MCP-1和TNF-α分泌的影響

ELISA結(jié)果顯示：在給予細(xì)胞100 μg/mL ox-LDL刺激不同時間后，MCP-1和TNF-α的分泌明顯上升，最高可達(dá)：1027.45 pg/mL和651.74 pg/mL。使用槲皮素預(yù)處理1 h后，可以有效減少MCP-1和TNF-α的分泌，最低可達(dá)：448.27 pg/mL和258.16 pg/mL，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，如圖2所示。

2.3 槲皮素對ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs TLR4-Myd88-NF-κB（p65）信號通路的影響

Western-blot結(jié)果顯示：使用100 μg/mL ox-LDL對VSMCs刺激24 h后，TLR4、Myd88和核內(nèi)NF-κB（p65）的表達(dá)明顯升高。槲皮素對細(xì)胞進行預(yù)處理1 h后，明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的TLR4和Myd88的高表達(dá)及NF-κB（p65）的核轉(zhuǎn)位，并具有濃度依賴性。在mRNA水平上，槲皮素顯著降低TLR4和Myd88基因的轉(zhuǎn)錄水平。提示：槲皮素能夠有效的抑制TLR4信號通路的激活。結(jié)果如圖3所示。

2.4 抑制劑對ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs MCP-1和TNF-α分泌的影響

為了進一步明確槲皮素對ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs炎癥抑制作用是否部分依賴于TLR4信號通路，先使用anti-TLR4抗體和NF-κB（p65）特異性抑制劑PDTC對細(xì)胞進行預(yù)處理1 h，再給予ox-LDL刺激6 h或24 h。ELISA結(jié) 果 提 示 ：anti-TLR4抗 體 和PDTC均能夠顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的MCP-1和TNF-α高表達(dá)，起到了與槲皮素相似的作用。以上結(jié)果提示：TLR4-Myd88-NF-κB（p65）信號通路的激活可能參與了ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs炎癥反應(yīng)過程。結(jié)果如圖4所示。

圖2 槲皮素抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs MCP-1和TNF-α的分泌

圖3 槲皮素抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs TLR4-Myd88-NF-κB (p65)信號通路的激活

圖4 抑制劑減少ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs MCP-1和TNF-α的分泌

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)病理性的炎癥反應(yīng)通過加速泡沫細(xì)胞堆積、VSMCs凋亡及纖維帽降解等方式，不僅增加斑塊的形成速度，同時也使已存在的穩(wěn)定性斑塊向易損性斑塊轉(zhuǎn)變，極大地影響著疾病的轉(zhuǎn)歸[4]。氧化應(yīng)激是斑塊內(nèi)部炎癥反應(yīng)的重要特征之一。在斑塊形成的初始階段，低密度脂蛋白（LDL）首先聚集于斑塊中央部位，隨后經(jīng)過一系列復(fù)雜的氧化修飾過程最終成為氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）[5]。Ox-LDL通過刺激巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs釋放多種炎癥因子和趨化因子，促進了斑塊的形成和失穩(wěn)[6]。因此，ox-LDL被認(rèn)為是一個強有力的致炎因子。

當(dāng)與內(nèi)毒素（LPS）、ox-LDL和AngII等內(nèi)源性及外源性配體結(jié)合后，TLR4通過自身活化，將細(xì)胞外信號經(jīng)由Myd88傳導(dǎo)，進而引發(fā)NF-κB（p65）核轉(zhuǎn)位，誘發(fā)靶向炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平升高[7]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)：ox-LDL能夠誘導(dǎo)VSMCs的炎癥因子過分泌，同時伴隨TLR4、Myd88表達(dá)升高及NF-κB（p65）核轉(zhuǎn)位增加，表明ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs炎癥反應(yīng)可能依賴于TLR4介導(dǎo)的炎癥通路的激活。槲皮素能夠有效抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs MCP-1和TNF-α過分泌，并具有濃度和時間依賴性，顯示出較強的抗炎作用[8]。同時，槲皮素可減少TLR4、Myd88的表達(dá)及NF-κB核轉(zhuǎn)位，抑制TLR4介導(dǎo)的炎癥通路的激活[9]。在使用anti-TLR4抗體及PDTC對TLR4和NF-κB進行特異性抑制后，也可以起到與槲皮素相似的抗炎作用。

以上結(jié)果提示：槲皮素可以有效地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs炎癥反應(yīng)，其抗炎作用可能依賴于對TLR4介導(dǎo)的炎癥通路的調(diào)節(jié)。這為槲皮素用于粥樣硬化性疾病的治療提供了一定的分子學(xué)基礎(chǔ)。

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