有機相陰離子交換固相萃取HPLC-UV法快速測定食品接觸材料中4種尼泊金酯的特定遷移量

肖曉峰，何 軍，劉艇飛，王建玲，陳 彤，楊娟娟，林 玲

(臺州出入境檢驗檢疫局，浙江 臺州 318000)

尼泊金酯，化學(xué)名為對羥基苯甲酸酯，常作為防霉防腐劑[1-2]廣泛應(yīng)用于塑料類食品接觸材料[3-4]、食品[5]、藥品[6-7]、化妝品[8]、潤滑油[9]等的生產(chǎn)。尼泊金酯類化合物對人體有內(nèi)分泌干擾作用[8]，并具有生物累積和富集作用[10-12]。近年來研究顯示，尼泊金酯類化合物與人體肥胖[2]、變異原致敏[13]、精子DNA損傷[14]有關(guān)，甚至可能致癌[8]。特定遷移量是指食品接觸材料或相關(guān)制品在使用過程中遷移至食品或食品模擬物中的單種化合物的量，通常是檢測浸泡了實際食品接觸材料或相關(guān)制品樣品后食品模擬物中特定化合物的含量[3-4,15]。在使用過程中，塑料類食品接觸材料相關(guān)制品中殘留或降解的尼泊金酯類化合物如過度遷移到食物中，將會直接危害人體健康[15]。歐盟2011年發(fā)布的(EU)NO 10/ 2011法規(guī)[4],將尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯的特定遷移量(SM)均限定為60 mg/kg。

目前，國內(nèi)外有關(guān)食品[12,16]、藥品[6-7,17]、化妝品[8,17]、生物[11]、尿液[13-14]、人體組織[10]、潤滑油[9]樣品中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯的檢測已有報道，檢測方法主要有高效液相色譜-紫外法(HPLC-UV)[6,9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[1,10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12]、流動注射法[7]，而關(guān)于食品模擬物中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯遷移量的檢測方法尚未見報道。

有機相陰離子交換(OPAE)固相萃取(SPE)技術(shù)[15]在處理植物油或植物油食品模擬物樣品中的酚類化合物時，具有操作簡便、快速、回收率高等優(yōu)點。本研究建立了有機相陰離子交換固相萃取/HPLC-UV法快速測定食品模擬物(3%乙酸、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇和橄欖油)中含酚羥基的尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯的SM。該方法已成功應(yīng)用于食品接觸材料相關(guān)制品中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯SM的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

1290超高效液相色譜儀、ZORBAX SB-Phenyl柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)購于Agilent公司；SunFireTMC8柱和xBridgeTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司)；Synergi 4u Polar-RP 80A柱(250 mm×4.6 mm，4 μm，菲羅門公司)；Oasis?MAX固相萃取柱(500 mg/6 mL，Waters公司);ELGA LA613純水儀(Veolia Water Solutions & Technologies公司)；親水性聚四氟乙烯、聚四氟乙烯過濾器(杭州格陵科學(xué)儀器有限公司)；尼泊金甲酯、尼泊金丙酯(純度≥99%，北京百靈威科技有限公司)；尼泊金乙酯(純度≥99%，Sigma-Aldrich公司)；尼泊金異丙酯(純度≥99%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；甲醇(色譜純，Merck公司)；四氫呋喃(色譜純，Tedia公司)；橄欖油(化學(xué)純，阿拉丁生化科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

混合標(biāo)準(zhǔn)(中間)儲備液的配制：稱取10 mg(精確至0.1 mg)尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得4種尼泊金酯質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液A。吸取 0.5 mL儲備液A至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得4種尼泊金酯質(zhì)量濃度均為50.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液B；分別精密吸取儲備液B 1.0、2.0 mL至2個10 mL容量瓶中，分別精密吸取儲備液A 1.0、2.0、4.0、8.0 mL至4個10 mL容量瓶中，用甲醇定容，連同標(biāo)準(zhǔn)儲備液A和B，得一組4種尼泊金酯質(zhì)量濃度均分別為5.00、10.0、50.0、100、200、400、800、1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液C。

水基食品模擬物(3%乙酸、10%乙醇、20%乙醇和50%乙醇)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：以50%乙醇食品模擬物為例，分別精確移取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲備液C至8個10 mL容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，混勻，得4種尼泊金酯質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液D；采用相同方式，用10%乙醇、3%乙酸或20%乙醇配制相同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

橄欖油食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別精確移取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲備液C至8個10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸四氫呋喃定容至刻度，混勻，得4種尼泊金酯質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液E。

1.2 遷移試驗

根據(jù)待測樣品的預(yù)期用途及使用條件，參照歐標(biāo)浸泡通則[18]和(EU) NO 10/2011法規(guī)，選擇合適的遷移試驗條件。分別用10%乙醇(食品模擬物A)、3%乙酸(食品模擬物B)、20%乙醇(食品模擬物C)、50%乙醇(食品模擬物D1)和橄欖油(食品模擬物D2)浸泡樣品。對可能較短時間與食品高溫接觸的聚丙烯(PP)塑料杯/碗、聚碳酸酯(PC)水壺/杯和密胺碗/杯等樣品，在100 ℃或回流溫度下浸泡2 h；對可能較短時間與較高溫度食品接觸的聚對苯二甲酸二乙醇酯(PET)杯、聚乙烯(PE)塑料瓶等，在70 ℃浸泡2 h；對室溫下與食品長時間接觸的聚氯乙烯(PVC)和聚乙烯(PE)保鮮膜等樣品，在40 ℃浸泡10 d。

1.3 樣品前處理

食品模擬物浸泡待測樣品，冷卻至室溫并混勻。水基食品模擬物(3%乙酸、10%乙醇、20%乙醇和50%乙醇)樣品：用2 mL注射器吸取1.5～2 mL浸泡液，經(jīng)0.45 μm親水性聚四氟乙烯針頭過濾器過濾至進樣瓶中，待測。

橄欖油食品模擬物樣品的制備參照OPAE SPE處理程序[15]稍加調(diào)整：稱取橄欖油模擬物5 g(精確至0.01 g)于20 mL容量瓶中，加入正己烷定容后渦旋混勻，待SPE上樣；用移液管準(zhǔn)確移取10 mL上樣液，上樣至經(jīng)6 mL正己烷平衡處理的Oasis?MAX SPE小柱中，用10 mL正庚烷淋洗SPE柱去除橄欖油干擾成分，殘留在柱床中的正庚烷用負壓抽干后，用5 mL 0.1%甲酸四氫呋喃溶液洗脫，洗脫液定容至5 mL，渦旋混勻后，用2 mL注射器吸取1.5～2 mL浸泡液，經(jīng)0.45 μm聚四氟乙烯針頭過濾器過濾至進樣瓶中，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-Phenyl柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent公司)；流動相為50%甲醇水溶液；洗脫方式為等度洗脫；流動相流速為1 mL/min；水基食品模擬物進樣量為20 μL，橄欖油樣品進樣量為7.5 μL；柱溫箱溫度為40 ℃；紫外檢測波長為256 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯這兩種同分異構(gòu)體之間的色譜分離相對較困難，相關(guān)文獻在等度洗脫條件下[16]，始終不能將兩者有效分離。采用“1.4”除色譜柱外的色譜分離條件，比較了常見的C8、C18、苯基柱和極性反相柱在等度洗脫條件下對這4種尼泊金酯的色譜分離效果，結(jié)果如圖1所示。尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯在C8柱上的色譜分離未能達到基線分離，在C18柱上存在一定的伸舌現(xiàn)象，在極性反相柱上存在明顯的拖尾現(xiàn)象，而在苯基柱上則均可達到基線分離，且峰形對稱，故試驗采用苯基柱進行色譜分離。

2.1.2等度條件及柱溫的選擇采用“1.4”除流動相比例外的色譜分離條件，在苯基柱上對比了45%甲醇水、50%甲醇水、55%甲醇水和60%甲醇水等度洗脫對4種尼泊金酯的色譜分離效果。結(jié)果表明，用45%甲醇水進行洗脫時，尼泊金丙酯的出峰時間延長至15 min；使用55%甲醇水或60%甲醇水進行洗脫時，尼泊金甲酯在5 min左右出峰，保留較弱；選用50%甲醇水等度洗脫時，4種尼泊金酯的色譜分離和保留時間均較理想。由于50%甲醇水溶液比純水的粘度大，柱后壓較高，將柱溫箱的溫度提升至苯基柱能耐受的40 ℃，能有效降低柱后壓，并能獲得更好的色譜保留重現(xiàn)性。故試驗采用50%甲醇水等度洗脫和40 ℃的柱溫。

2.1.3進樣量的優(yōu)化考察了水基食品模擬物和橄欖油食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的進樣量對色譜分離和峰形的影響。采用“1.4”除進樣量外的色譜分離條件，100 mg/mL的50%乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進樣1、5、10、15、20 μL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將進樣量增加至20 μL未發(fā)生色譜分離保留時間延長或色譜峰變形等異?，F(xiàn)象，其他3種水基食品模擬物也類似，故水基食品模擬物樣品的進樣量選用20 μL。將100 mg/mL的0.1%甲酸四氫呋喃混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進樣1.0、2.5、5.0、7.5、10 μL，當(dāng)進樣量增加至10 μL時，4種尼泊金酯的色譜峰出現(xiàn)明顯的伸舌或雙峰形變，故橄欖油食品模擬物樣品進樣量選用7.5 μL。在上述優(yōu)化色譜條件下，5種食品模擬物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的4種尼泊金酯色譜分離較理想。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1不同材質(zhì)針式濾膜過濾對回收率的影響水基食品模擬物采用過針頭式濾膜后直接進樣的方式，可以有效去除樣品中的細小顆粒物或其他雜物，減少對色譜柱和儀器管道的堵塞?？疾炝?種常見材質(zhì)的針頭式濾膜(聚醚砜(PES)、尼龍(NL)和親水性聚四氟乙烯(PTFE))過濾操作對水基食品模擬物回收率的影響。將同一20 mg/L的水基食品模擬物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行過濾或直接進樣，通過比較前述3種不同材質(zhì)的針頭式濾膜進樣和直接進樣時的色譜峰面積來計算回收率，每種水基食品模擬物均平行試驗6次。發(fā)現(xiàn)在20%乙醇食品模擬物中，經(jīng)聚醚砜、尼龍和親水性聚四氟乙烯材質(zhì)的針頭式濾膜過濾處理后，4種尼泊金酯的回收率分別為93.6%～98.5%、81.8%～97.3%和98.8%～100%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.19%～0.44%、1.6%～4.3%、0.06%～0.23%，其他3種水基食品模擬物結(jié)果類似。實驗表明親水性聚四氟乙烯的回收率最好，故水基食品模擬物均使用親水性聚四氟乙烯針頭濾膜過濾。

2.2.2有機相陰離子交換SPE法采用OPAE SPE法[15]對橄欖油食品模擬物樣品進行前處理，并根據(jù)實際情況進行調(diào)整：①橄欖油食品模擬物中4種尼泊金酯的OPAE SPE法操作過程中無需添加四甲基胍。雖然在OPAE SPE法操作程序中，添加四甲基胍能顯著增加某些酚類化合物過SPE柱的回收率[15]，但實驗表明，4種尼泊金酯在不添加四甲基胍的情況下也獲得了滿意的回收率，故本文的OPAE SPE過程無需添加四甲基胍。②洗脫劑使用0.1%甲酸四氫呋喃能獲得滿意的洗脫效果。OPAE SPE法中上樣溶劑使用了強堿性的四甲基胍，在洗脫時需要使用較高濃度(0.5%)的甲酸以保證洗脫時SPE柱的酸性環(huán)境，而本文未添加四甲基胍，洗脫時只需使用0.1%甲酸四氫呋喃即可獲得滿意的洗脫效果。與常規(guī)的陰離子交換SPE操作方法相比，OPAE SPE法分析橄欖油中含酚羥基的目標(biāo)化合物具有操作簡便、重復(fù)性好、回收率高，可高效富集和凈化的特點，而常規(guī)的陰離子交換SPE操作方法，需采用水溶液反復(fù)提取橄欖油中含酚羥基的目標(biāo)化合物，操作繁瑣，并且由于水溶液提取效果不佳而導(dǎo)致回收率不理想。

2.3 方法的線性關(guān)系及定量下限

將“1.1”配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次進樣測定，以質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo),色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制校正曲線，回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表1。5種食品模擬物中4種尼泊金酯在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2≥0.999 8),符合定量檢測要求；考察了校準(zhǔn)曲線工作溶液最低點的信噪比，以信噪比(S/N)為10作為方法定量下限(LOQ)，4種尼泊金酯在5種食品模擬物中的LOQ為0.1～0.5 mg/kg,滿足歐盟(EU)NO 10/ 2011法規(guī)的限量(60 mg/kg)要求。

表1 4種尼泊金酯的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、線性方程及定量下限Table 1 Linear ranges，correlation coefficients，regression equations,limits of quantitation for 4 parabens

2.4 回收率與精密度

用實際樣品浸泡液加標(biāo)的方式進行回收率試驗。每種食品模擬物浸泡液分別添加4種尼泊金酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至10、50、100 mg/kg，按照“1.3”步驟處理，加標(biāo)回收率結(jié)果如表1所示，4種尼泊金酯在5種食品模擬物中的加標(biāo)回收率為97.9%～103%,RSD為0.02%～2.2%，說明本方法對包括采用了OPAE SPE法[15]進行前處理的橄欖油食品模擬物浸泡液在內(nèi)的5種食品模擬物樣品，有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

2.5 實際樣品的檢測

采用本方法檢測了聚丙烯(PP)塑料杯、PP碗、聚碳酸酯(PC)水壺、PC杯、密胺碗、密胺杯、聚對苯二甲酸二乙醇酯(PET)杯、聚乙烯(PE)塑料瓶、聚氯乙烯(PVC)和聚乙烯(PE)保鮮膜等常見食品接觸材料樣品共50余批次，在一款密胺復(fù)合材質(zhì)藍色波浪碗的50%乙醇食品模擬物浸泡液中檢出尼泊金異丙酯(圖2B)。50余批次樣品的食品模擬物浸泡液均無明顯干擾，實際樣品的典型色譜圖見圖2。且5種食品模擬物浸泡液加標(biāo)回收率和精密度好，表明該方法具有較好的實用性。

圖2 50%乙醇浸泡不同材質(zhì)的食品接觸材料制品的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of soaking solution of 50%ethanol from different types of food contacting samplesA:5 mg/kg mixing standard;B:melamine composite bowl;1：methylparaben；2:ethylparaben;3:isopropylparaben；4：propylparaben

3 結(jié) 論

本文建立了有機相陰離子交換固相萃取/HPLC-UV法快速測定食品接觸材料中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯的SM。該方法具有樣品處理簡單快速、色譜分離效果和線性相關(guān)性好、回收率和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，且方法的定量下限低，完全能滿足歐盟(EU)NO 10/ 2011法規(guī)的限量要求。該方法已應(yīng)用于多種食品接觸材料相關(guān)制品中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯的檢測，可廣泛應(yīng)用于食品接觸材料相關(guān)制品中此4種尼泊金酯化合物的進出口監(jiān)管及產(chǎn)品質(zhì)量控制。

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