固相萃取/定量核磁共振波譜法測(cè)定乳增寧膠囊中的淫羊藿苷

劉曉婷，李苗苗，肖 坤，郭強(qiáng)勝，許 旭

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418)

定量核磁共振波譜法(qNMR)相比于HPLC、GC-MS、LC-MS，具有無(wú)需待測(cè)物的高純標(biāo)準(zhǔn)品等優(yōu)勢(shì)[1-2]。該法根據(jù)不同化學(xué)環(huán)境下質(zhì)子NMR峰面積正比于質(zhì)子數(shù)進(jìn)行定量分析[3]，是解決無(wú)標(biāo)樣定量分析問(wèn)題的重要途徑。近年來(lái)qNMR方法被廣泛用于中藥[4-7]、化學(xué)藥[8-9]、食品[10]和代謝組學(xué)[11-13]等的研究。中國(guó)藥典于2010版開(kāi)始將該技術(shù)作為法定標(biāo)準(zhǔn)收載于通則(附錄)中[14-15]。

乳增寧由艾葉、淫羊藿、天冬、柴胡、土貝母等多種中藥組成[16],淫羊藿苷(Icariin)是處方中淫羊藿的主要活性成分[17-18]。近年來(lái)，對(duì)乳增寧膠囊中淫羊藿苷含量的測(cè)定已有不少研究，謝東等[19]將樣品超聲提取后采用柱層析和紫外法分析，汪濤等[20]、張玉婷等[21]超聲提取后分別建立HPLC方法進(jìn)行定量分析。但中藥制劑成分復(fù)雜，樣品中的強(qiáng)保留物對(duì)HPLC法柱子損傷較大[22]。李瑋玲、李瑾翡等[23-24]分別使用固相萃取(SPE)后再用HPLC分析樣品中的淫羊藿苷；干劍欽等[25]將腎寶合劑樣品提取后用SPE柱處理后，用HPLC法分析其中的淫羊藿苷。這些HPLC方法在測(cè)定時(shí)均需要淫羊藿苷標(biāo)樣。

qNMR方法無(wú)需待測(cè)物的高純標(biāo)準(zhǔn)品，只需常用的幾種內(nèi)標(biāo)和氘代試劑即可完成定量分析[1]，是常用中藥分析方法的重要補(bǔ)充。但用于低含量成分分析時(shí)會(huì)存在靈敏度和干擾等問(wèn)題。禹珊等[26]將兩次丙酮提取后的樣品水浴旋干后溶于少量氘代試劑，通過(guò)提高濃度來(lái)改善靈敏度。Yang等[7]使用氘代三氟乙酸使原本互相干擾的定量峰分離。

固相萃取(SPE)作為一種方便有效的樣品前處理方法，具有凈化樣品和富集濃縮待測(cè)組分等功能。將SPE與qNMR結(jié)合，可以有效地解決qNMR的靈敏度和干擾問(wèn)題。已有一些文獻(xiàn)直接采用SPE/qNMR方法測(cè)定樣品，如van der Hooft等[27]將尿液樣品過(guò)HLB型SPE柱，4 mL甲醇洗脫后采用HPLC-TOF MS-SPE/NMR(1H NMR、2D-NMR)等對(duì)飲茶后人體尿液樣品中的代謝物進(jìn)行直接定性定量分析。Wagner等[28]使用SPE/qNMR分析污染工業(yè)廢水中的原油和正己烷。Godejohann等[29]將SPE結(jié)合HPLC-UV與1H NMR對(duì)污染物進(jìn)行了定量分析。但目前對(duì)SPE/qNMR聯(lián)用方法進(jìn)行系統(tǒng)研究、并做方法驗(yàn)證的文獻(xiàn)報(bào)道不多。Pieri等[30]將樣品提取物用C18型SPE柱凈化富集，以dDMSO洗脫后用qNMR內(nèi)標(biāo)法測(cè)定了朝鮮薊葉提取物中的萊薊苦素。Moura[31]等將加入內(nèi)標(biāo)的樣品溶液用C18型SPE進(jìn)行富集凈化后用qNMR測(cè)定了環(huán)境和生物樣品中的β-N-甲基氨基-L-丙氨酸，并做了方法驗(yàn)證。Li等[32]將收集的42種黨參樣品提取后采用C18型SPE柱處理，用qNMR測(cè)定了4種生物堿。本課題組采用MCX型SPE柱結(jié)合qNMR定量測(cè)定了板藍(lán)根飲片中的表告依春，并對(duì)重復(fù)性、精密度、線性、回收率等作了方法驗(yàn)證[33]。

本實(shí)驗(yàn)將SPE與qNMR結(jié)合，以乳增寧膠囊為樣品，用SPE凈化樣品并富集濃縮待測(cè)組分含量，建立了SPE/qNMR測(cè)定乳增寧膠囊中有效成分淫羊藿苷含量的方法。對(duì)所建立方法的精密度、線性范圍、靈敏度、回收率等進(jìn)行了驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)無(wú)需對(duì)照品即可實(shí)現(xiàn)對(duì)乳增寧膠囊中淫羊藿苷的定量測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE Ⅲ 500MHz核磁共振譜儀(德國(guó)Bruker公司)；U-3000高效液相色譜儀(Thermo-Fisher公司)；M2p高精密天平(精度0.001 mg，德國(guó)Startoriu公司)；AB204-N精密天平(精度0.1 mg，上海世義精密儀器有限公司)；VGT-2120QT超聲波清洗儀(廣東固特超聲實(shí)業(yè)有限公司)；800B高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DC-12氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。CNWBOND HC-C18固相萃取柱(2 g，10 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；Innoval Neo XD高效液相色譜C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，Agela Technologies)。

淫羊藿苷(Icariin，中國(guó)廣州分析測(cè)試中心科力技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)；2,3,5-三碘苯甲酸(>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；鄰苯二甲酸氫鉀(基準(zhǔn)物質(zhì)，99.95%～100.05%，上海泰坦科技股份有限公司)；氘代二甲基亞砜(d6-DMSO，99.9%D，Cambridge Isotope Lab.Inc.)；甲醇(HPLC級(jí)，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司)；乙腈、乙醇為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)室用水為屈臣氏蒸餾水。乳增寧膠囊樣品1(蚌埠豐原涂山制藥有限公司，批號(hào)：161104)；樣品2(修正藥業(yè)集團(tuán)長(zhǎng)春高新制藥有限公司，批號(hào)：160901)；樣品3(蚌埠豐原涂山制藥有限公司，批號(hào)：161024)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理精密稱取乳增寧膠囊內(nèi)容物0.25 g，置于具塞錐形瓶中，加入10%乙醇10 mL，稱重，超聲提取40 min，取出放冷后再稱重，加10%乙醇補(bǔ)充損失的質(zhì)量。4 000 r/min離心5 min后，收集上層清液，過(guò)濾除去初濾液，收集續(xù)濾液。

依次用10 mL甲醇和10 mL水活化CNWBOND HC-C18SPE固相萃取柱(2 g，10 mL)。將6 mL上述續(xù)濾液過(guò)柱，加壓控制流速大約為3秒/滴。之后用2 mL水對(duì)柱子進(jìn)行淋洗。依次用2 mL乙腈和2 mL 45%乙腈進(jìn)行洗脫。洗脫液用氮?dú)獯抵?.1 mL，加入0.4 mL氘代DMSO，再加入精密稱取的2,3,5-三碘苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)，混合均勻后轉(zhuǎn)移至核磁管中。

1.2.2HPLC檢測(cè)條件參考2015版中國(guó)藥典[16]以及相關(guān)文獻(xiàn)[25]，選擇用于考察SPE操作方法的HPLC檢測(cè)條件為：Innoval Neo XD C18色譜柱(150 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相甲醇-水(60∶40，體積比)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

1.2.3核磁共振定量核磁共振(NMR)采集條件：脈沖寬度P1=14.1 μs，延遲時(shí)間d1=1 s，掃描次數(shù)NS=256，譜寬SW=20 ppm，中心頻率O1=3 090 Hz，采樣時(shí)間AQ=3.17 s，于室溫下測(cè)得核磁共振圖譜。用Topspin軟件將定量峰處的基線調(diào)平，然后選擇相應(yīng)質(zhì)子峰的積分區(qū)間，將每個(gè)峰積分3～5次，當(dāng)RSD < 1%時(shí)取平均值。采用2010版中國(guó)藥典定量核磁共振技術(shù)的絕對(duì)定量公式(1)計(jì)算淫羊藿苷的含量[14-15]：

Ws=Wr×(As/Ar)×(Es/Er)

(1)

式中，Wr為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，Es為供試品的質(zhì)子當(dāng)量重量(分子量除以特征峰的質(zhì)子數(shù))，Er為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)子當(dāng)量重量，As為供試品的峰面積，Ar為內(nèi)標(biāo)峰的峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品制備方法的選擇

2.1.1樣品提取條件的優(yōu)化乳增寧中淫羊藿苷的提取方法以超聲波提取為主[19-21]，本實(shí)驗(yàn)用“1.2.2”的HPLC檢測(cè)條件考察了提取次數(shù)影響。稱取乳增寧膠囊內(nèi)容物0.25 g，按“1.2.1”對(duì)樣品進(jìn)行前處理后，檢測(cè)續(xù)濾液。結(jié)果顯示，第2次超聲后續(xù)濾液中淫羊藿苷的峰面積僅為第1次提取的1/70。因此本實(shí)驗(yàn)選擇1次超聲提取。

中國(guó)藥典中對(duì)淫羊藿苷采用超聲提取(功率360 W，頻率50 kHz) 40 min[16]。本實(shí)驗(yàn)超聲儀器功率為400 W，根據(jù)藥典分別考察超聲提取10、20、30、40、50、60 min對(duì)淫羊藿苷提取效果的影響。根據(jù)峰面積估計(jì)淫羊藿苷的含量。結(jié)果顯示，超聲40 min時(shí)，直接HPLC測(cè)定的淫羊藿苷峰面積較大，繼續(xù)增加時(shí)間響應(yīng)值(峰面積)差異不大。故選擇超聲時(shí)間為40 min。

綜合以上實(shí)驗(yàn)，最終選擇乳增寧膠囊中淫羊藿苷的提取方法為：40 min超聲提取1次。棄去前2 mL初濾液，取續(xù)濾液6 mL過(guò)固相萃取小柱。

2.1.2固相萃取條件的選擇優(yōu)化了SPE柱的類型及其活化、樣品溶劑類型、上樣量、柱淋洗劑的類型、柱洗脫劑的類型、洗脫劑用量7個(gè)條件，以選擇合適的固相萃取條件。

SPE柱及其活化：文獻(xiàn)中[23-25]多采用C18柱純化淫羊藿苷，本實(shí)驗(yàn)使用C18柱也取得了較好的效果，因此選擇C18柱。通過(guò)比較，選擇用10 mL甲醇與10 mL水活化平衡C18固相萃取柱。

樣品溶劑的選擇：考察了30%乙腈、60%甲醇、水、5%乙醇、10%乙醇、70%乙醇6種溶劑溶解乳增寧膠囊內(nèi)容物時(shí)對(duì)淫羊藿苷的保留效果。結(jié)果顯示，用30%乙腈、60%甲醇、70%乙醇作為樣品溶劑進(jìn)行上樣時(shí)均有大量的淫羊藿苷漏下。用水、5%乙醇與10%乙醇作為溶劑上樣時(shí)對(duì)淫羊藿苷的保留效果最好，但由于水與5%乙醇對(duì)于乳增寧中淫羊藿苷的提取率比10%乙醇差，所以實(shí)驗(yàn)選用10%乙醇。

上樣量：將8 mL續(xù)濾液過(guò)柱，分別接第2、4、6、8 mL流出液進(jìn)行檢測(cè)，前6 mL淫羊藿苷均能夠很好地保留在柱上，后2 mL會(huì)有少量淫羊藿苷漏出，所以最終選擇上樣量為6 mL。

淋洗劑：選擇2 mL水進(jìn)行淋洗，并將流出液收集進(jìn)行檢測(cè)，均未檢測(cè)到淫羊藿苷。

洗脫劑：考察了用甲醇、乙腈、45%乙腈洗脫淫羊藿苷和后續(xù)吹干的效果，發(fā)現(xiàn)用相同體積的甲醇或乙腈不能完全洗脫淫羊藿苷，最終選擇用乙腈與45%的乙腈相結(jié)合的方法進(jìn)行洗脫。

洗脫劑用量：先用乙腈2 mL洗脫，然后用45%乙腈4 mL分2次，每次2 mL繼續(xù)洗脫，收集洗脫液，并對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，第5～6 mL洗脫液中淫羊藿苷的峰面積大約為第1～2 mL洗脫液的0.3%，因此本實(shí)驗(yàn)選擇的洗脫劑用量為乙腈和45%乙腈各2 mL。

綜上所述，固相萃取的最終條件為：活化：10 mL甲醇、10 mL水；上樣：6 mL 10%乙醇；淋洗：2 mL水；洗脫：2 mL乙腈，2 mL 45%乙腈。

2.2 氘代試劑的選擇

將得到的4 mL洗脫液氮?dú)獯蹈珊笥貌煌碾軇┤芙猓鶧MSO能很好地溶解產(chǎn)物，并對(duì)定量峰無(wú)干擾，因此實(shí)驗(yàn)選擇氘代DMSO作為溶劑。

2.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

考察了幾種常用的內(nèi)標(biāo)物(鄰苯二甲酸氫鉀、苯甲酸和2,3,5-三碘苯甲酸)的效果，其中前兩者的NMR峰均會(huì)與樣品NMR峰有重疊，而2,3,5-三碘苯甲酸與樣品組分互相不干擾，因此選擇2,3,5-三碘苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)物。

2.4 信號(hào)歸屬及定量峰的確認(rèn)

圖1 淫羊藿苷標(biāo)液與內(nèi)標(biāo)2,3,5-三碘苯甲酸的1H NMR譜圖Fig.1 NMR spectra of icariin standard and 2,3, 5-triiodobenzoate internal standardA.icariin；B.2,3,5-triiodobenzoate；C.the mixture of A and B

圖2 乳增寧膠囊樣品及其加標(biāo)混合物的1H NMR譜圖Fig.2 NMR spectra of Ruzengning capsule sample and mixed chemical referencesA.sample；B.the enlarge part of Fig.A；C.mixture of sample and 2,3,5-triiodobenzoate；D.mixture of icariin and 2,3,5-triiodobenzoate

2.4.1NMR峰歸屬采用“1.2.3”方法分別測(cè)定淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)標(biāo)2,3,5-三碘苯甲酸以及兩者混合物的NMR譜圖(見(jiàn)圖1)。對(duì)比圖1中的核磁圖，并參考文獻(xiàn)[34]，歸屬混合物(圖1C)中的各信號(hào)峰。

淫羊藿苷的峰：δ1.607(5”-H,s,3H)；δ1.691(4”-H,s,3H)；δ3.861(OCH3,s,3H)；δ5.013(Glc-1-H,d,1H)；δ5.165(2”-H,t,1H)；δ5.287(Rha-1-H,d,1H)；δ6.638(6-H,s,1H)；δ7.126～7.143(3’,5’-H,d,2H)；δ7.890～7.909(2’,6’-H,d,2H)；δ12.574(5-OH,s,1H)。

2,3,5-三碘苯甲酸峰：δ7.749～7.751(d,1H)；δ8.330～8.338(d,1H)。

2.4.2定量峰的確認(rèn)采用“1.2”方法，測(cè)得樣品1的NMR圖譜見(jiàn)圖2A，樣品和內(nèi)標(biāo)物混合物的NMR譜圖見(jiàn)圖2D。

qNMR定量峰需滿足分離度較好，信噪比≥150等要求。圖2C中識(shí)別的兩個(gè)淫羊藿苷的特征峰1和2均能滿足要求，由于峰1處的基線較平，更適合做定量峰，因此選擇δ7.890～7.909(2’,6’-H,d,2H)(圖2C峰1)作為定量峰。同樣，根據(jù)條件選擇δ8.330～8.338(d,1H)作為內(nèi)標(biāo)的定量峰(圖2C峰IS)。

2.4.3核磁實(shí)驗(yàn)參數(shù)的影響分別考察了脈沖寬度P1、延遲時(shí)間d1和掃描次數(shù)NS對(duì)積分面積的影響。當(dāng)P1≥14.1 μs，d1=1 s，NS≥256時(shí)，淫羊藿苷定量峰和內(nèi)標(biāo)定量峰的信噪比可以達(dá)到定量要求(S/N≥150)，且測(cè)定的Ar與As值趨于穩(wěn)定。故實(shí)驗(yàn)選定核磁參數(shù)P1=14.1 μs，d1=1 s，NS=256。

2.4.4對(duì)2,3,5-三碘苯甲酸及淫羊藿苷純品的含量校正實(shí)驗(yàn)使用的淫羊藿苷和內(nèi)標(biāo)采用qNMR法進(jìn)行含量校正。在“1.2.3”實(shí)驗(yàn)條件下，以DMSO為溶劑，基準(zhǔn)物質(zhì)鄰苯二甲酸氫鉀的NMR峰H-4,5(7.502～7.520,dd,2H)與三碘苯甲酸的NMR定量峰互不干擾。所以選擇鄰苯二甲酸氫鉀作為校準(zhǔn)2,3,5-三碘苯甲酸(定量峰為H-4(δ7.695～7.699,d,1H ))和淫羊藿苷(定量峰δ7.126～7.143(3’,5’-H,d,2H))含量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。采用定量核磁共振技術(shù)的絕對(duì)定量模式對(duì)內(nèi)標(biāo)和淫羊藿苷純品進(jìn)行含量校正。重復(fù)試驗(yàn)6次，取平均值。實(shí)驗(yàn)測(cè)得內(nèi)標(biāo)的含量為99.3%，RSD為0.59%；淫羊藿苷純品含量為96.4%，RSD為0.65%。以下實(shí)驗(yàn)使用校正后的含量值進(jìn)行。

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1精密度取樣品1按照“1.2.1”方法制成待測(cè)樣品，分別在日內(nèi)和日間各做6組測(cè)試，以淫羊藿苷定量峰δ7.890～7.909(2’,6’-H,d,2H)與內(nèi)標(biāo)峰δ8.330～8.338(d,1H)的積分面積(As/Ar)為指標(biāo)，驗(yàn)證qNMR方法的精密度。日內(nèi)RSD為0.43%，日間RSD為0.75%。表明定量核磁共振技術(shù)的精密度好，樣品的穩(wěn)定性好。

2.5.2線性與分析性能稱取6組淫羊藿苷(0.403 3～2.111 mg)和1.5 mg內(nèi)標(biāo)，溶解于0.5 mL氘代DMSO中，超聲溶解后，按“1.2”方法獲得核磁共振譜圖。選擇淫羊藿苷與2,3,5-三碘苯甲酸質(zhì)量比(x)為橫坐標(biāo)，核磁共振圖譜中淫羊藿苷與2,3,5-三碘苯甲酸峰面積比(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.432 7x,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

根據(jù)“1.2.3”公式(1)理論計(jì)算出淫羊藿苷線性曲線的斜率(Es/Er)為1.477 3,與實(shí)驗(yàn)中測(cè)得淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率值接近，說(shuō)明在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)，可以采用qNMR技術(shù)的絕對(duì)定量公式來(lái)直接計(jì)算淫羊藿苷的含量，而不必使用對(duì)照品。

2.5.3檢出限與定量下限根據(jù)2015版中國(guó)藥典四部通則[14]，qNMR的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)由基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的公式LOD = 10δ/S，LOQ = 3.3δ/S得到，式中δ采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)計(jì)算。得淫羊藿苷的LOD=0.020 3 mg，LOQ=0.061 4 mg。本實(shí)驗(yàn)中內(nèi)標(biāo)的用量約為1.5 mg，溶劑0.5 mL計(jì)算得淫羊藿苷的LOD=0.061 g/L，LOQ=0.184 g/L。英國(guó)藥典[35]對(duì)qNMR方法要求信噪比S/N≥150∶1，這也被認(rèn)為是LOQ的指標(biāo)，以樣品1的NMR測(cè)定譜峰信噪比，根據(jù)定量核磁共振技術(shù)的絕對(duì)定量公式[14-15]計(jì)算得淫羊藿苷的LOQ為0.173 g/L。綜上，可以認(rèn)為本方法對(duì)淫羊藿苷的LOQ為0.184 g/L，LOD為0.061 g/L。按照本實(shí)驗(yàn)中約0.5 mL溶劑的量和約0.25 g乳增寧的樣品量，可算出本法測(cè)定乳增寧膠囊中淫羊藿苷含量的LOD為0.122 mg/g；LOQ為0.368 mg/g，相當(dāng)于0.036 8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

表1 樣品提取后的qNMR方法回收率(n=3)Table 1 Recovery of icariin by qNMR after the sample extraction(n=3)

表2 包括樣品提取過(guò)程的SPE/qNMR方法回收率(n=3)Table 2 Recovery of icariin including the extraction process(n=3)

2.5.4樣品提取后qNMR方法的回收率取樣品用“1.2”方法測(cè)定其中淫羊藿苷的含量，然后將相同的樣品提取溶液再取3份，在每份溶液中加入淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品(淫羊藿苷對(duì)照品含量為96.4%)后再測(cè)定含量，計(jì)算除去樣品提取過(guò)程的qNMR方法的加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。淫羊藿苷的回收率為98.1%～100.2%，RSD為1.1%。

2.5.5包括樣品提取過(guò)程的SPE/qNMR方法回收率分別準(zhǔn)確稱取3份0.25 g樣品1，每份均加入一定量的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品，用“1.2”提取分析方法對(duì)樣品進(jìn)行定量。結(jié)果如表2，得到包括樣品SPE預(yù)處理過(guò)程的淫羊藿苷的回收率為99.8%～103.0%，RSD為1.6%。

2.6 樣品分析

按“1.2”方法，稱取不同廠家和批號(hào)不同的乳增寧膠囊內(nèi)容物，重復(fù)測(cè)定3次樣品1、2、3的平均值分別為3.95、4.39、4.11 mg/g,RSD分別為1.9%、1.4%和0.75%。按照2015版中國(guó)藥典每粒乳增寧膠囊中的淫羊藿苷的測(cè)定不低于1.5 mg/g[16]的規(guī)定，3個(gè)樣品均符合要求。

3 結(jié) 論

建立了SPE/qNMR測(cè)定乳增寧膠囊中淫羊藿苷含量的方法，將樣品通過(guò)SPE進(jìn)行富集純化，改善了qNMR的檢測(cè)靈敏度。方法精密度好，定量分析結(jié)果可靠，在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)，可以不用淫羊藿苷對(duì)照品，直接以qNMR絕對(duì)定量公式來(lái)計(jì)算淫羊藿苷的含量。

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