多壁碳納米管分散固相萃取結合在線GPC/GC-MS/MS技術同時檢測茶葉中40種有機磷農藥

朱炳祺，金紹強，田春霞，胡 帆，徐瀟穎，羅金文

(浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310000)

中國作為茶葉種植歷史最悠久、種植面積最大的國家，產量和出口量均居世界前列，而茶葉的生產消費在我國經濟、文化、生活等領域有著重要的地位[1]。針對茶葉的食用安全問題，以歐盟和日本為代表的茶葉進口國家和地區(qū)相繼出臺了嚴格的法令以規(guī)定茶葉中農藥的最大殘留限量(MRL)[2]。由歐盟發(fā)布的一份關于茶葉的調查報告顯示，2013年有24.3%來自中國被抽檢的茶葉產品中的農藥殘留量超標，其中包括三唑磷、毒死蜱等有機磷農藥[3]。近年來，我國不斷更新相關檢測以及限量標準，對茶葉產品中的農藥殘留量限定也越來越嚴格。

有機磷類農藥作為殺蟲劑，廣泛應用在各類農產品的種植過程中，是農產品質量安全控制的重要檢測指標[4-5]。目前，我國在茶葉種植過程中已登記的有機磷農藥包括敵敵畏、敵百蟲、殺螟硫磷、馬拉硫磷、辛硫磷、樂果。而在日常檢驗中發(fā)現三唑磷、毒死蜱、馬拉硫磷、殺螟硫磷、水胺硫磷等多種農藥在茶葉樣品中有檢出[6-8]，因此建立茶葉中有機磷農藥多殘留檢測的有效方法，對日常監(jiān)測工作具有實際意義。茶葉樣品基質復雜，分析時若前處理凈化效果不佳容易對儀器和色譜柱造成污染，影響目標化合物的定性定量分析[2]。因此，亟需建立有效的樣品前處理技術以減少基質干擾?，F行的國家標準[9-11]均采用固相萃取(SPE)法進行凈化，SPE柱凈化效果雖好，但價格較昂貴，操作繁瑣。近年來，分散固相萃取(DSPE)技術發(fā)展迅速，其改進而成的QuEChERS方法已成為AOAC 2007.01 和EN 15662官方方法[12-13]，但該方法所使用的N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑對復雜基質的凈化效果并不理想。多壁碳納米管(MWCNTs)是碳六元環(huán)構成的類石墨平面卷曲而成的納米級中空管，具有極大的比表面積，因此吸附容量更大，吸附性能更佳[14-15]。MWCNTs優(yōu)異的吸附性能使其可應用在前處理過程中，并通過吸附基質干擾物而達到凈化樣品的目的。目前，僅有少量學者對此進行了研究[16-17]。

凝膠滲透色譜(GPC)凈化技術根據分子量的大小對樣品中目標物和基質干擾物進行分離，有較好的凈化效果[18-19]。相對于傳統(tǒng)離線GPC凈化存在的操作繁瑣、溶劑消耗量大等問題，在線GPC技術極大減少了溶劑消耗，將其與氣相色譜-質譜(GC-MS)串聯實現了對樣品GPC凈化和GC-MS分析全過程的自動化，具有重要的應用價值[20]。在針對茶葉中有機磷農藥的檢測方面，GPC 與 GC-MS聯用已有報道，但GPC與氣相色譜串聯三重四極桿質譜(GC-MS/MS)在線串接使用的文獻報道極少[20-21]。GC-MS/MS較GC-MS具有更好的抗干擾能力和更高的靈敏度。此外，采用MWCNTs為吸附劑的DSPE方法操作簡便，凈化效果優(yōu)異。結合以上優(yōu)勢，本研究發(fā)展在線凝膠色譜-氣相色譜三重四極桿串聯質譜(GPC/GC-MS/MS)技術并利用MWCNTs開發(fā)高效DSPE前處理方法，建立了一種同時測定茶葉中40種有機磷農藥的經濟、高效、靈敏的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TQ 8040在線GPC/GC-MS/MS系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)；臺式離心機(美國Thermo Fisher公司)；電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

茶葉樣品為市售預包裝茶葉(包括綠茶、紅茶、烏龍茶)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲苯、環(huán)己烷、丙酮(色譜純，美國Tedia公司)；無水硫酸鎂(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；MWCNTs(直徑8～15 nm，長度50 μm，純度95%，比表面積大于140 m2/g，中科院成都有機化學有限公司)，TPT固相萃取凈化柱(1 000 mg/6 mL，天津Agela公司)；農藥對照品：滅線磷、治螟磷、甲拌磷、樂果、特丁硫磷、胺丙畏、地蟲硫磷、二嗪磷、乙拌磷、除線磷、甲基毒死蜱、甲基對硫磷、皮蠅磷、對氧磷、甲基嘧啶磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對硫磷、水胺硫磷、毒壤磷、溴硫磷、嘧啶磷、異丙胺磷、喹硫磷、殺撲磷、乙基溴硫磷、殺蟲畏、滅菌磷、丙溴磷、乙硫磷、三唑磷、伐滅磷、亞胺硫磷、苯硫磷、伏殺硫磷、定菌磷、乙基谷硫磷、蠅毒磷(質量濃度均為1 000 mg/L，農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所)。

1.2 實驗方法

1.2.1標準溶液的配制分別移取上述農藥標準品各100 μL于10 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度得質量濃度為10 mg/L的混合標準儲備液。精密移取混合標準儲備液于容量瓶中，用丙酮稀釋，配制成質量濃度為1 mg/L的混合標準使用液。取混合標準使用液，以經前處理的空白樣品溶液為溶劑，配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L系列基質匹配混合標準工作液。

1.2.2樣品的前處理樣品提取：取粉碎均勻的茶葉樣品4 g于50 mL離心管中，精確加入10.0 mL乙腈，旋渦混合1 min，超聲提取20 min后以5 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

樣品凈化：移取上清液1.0 mL，加入1.0 mL甲苯，轉入含有分散固相萃取吸附劑的15 mL離心管中(含MWCNTs 30 mg，無水硫酸鎂150 mg)，旋渦混勻2 min，于4 000 r/min離心10 min。經0.22 μm濾膜過濾后，待測定。

1.2.3在線GPC/GC-MS/MS條件GPC條件：凝膠滲透色譜柱：Shodex EV-200(150 mm×2 mm)；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：210 nm；泵流速：0.1 mL/min；流動相：丙酮-環(huán)己烷溶液(體積比3∶7)。

GC-MS/MS條件：預柱：RXi-5Sil MS(5 m×0.25 mm×0.25 μm)；色譜柱：RXi-5Sil MS(25 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣方式：程序升溫汽化(PTV)進樣，不分流進樣；載氣：氦氣(純度≥99.999%)；柱流量：1.75 mL/min；進樣口升溫程序：120 ℃保持5 min，以100 ℃/min升至250 ℃，保持33.7 min；柱溫箱升溫程序：82 ℃保持5 min ，以8 ℃/min升至280 ℃，保持7.75 min；離子源：EI，250 ℃。

2 結果與討論

2.1 在線GPC/GC-MS/MS分析方法的建立

如圖1所示，GPC/GC-MS/MS由GPC和GC-MS/MS兩部分串聯組成[22]。首先，目標物和樣品基質在GPC色譜柱中得到分離，目標物餾分被收集于定量環(huán)中。隨后將該餾分注入氣相色譜柱中，目標物在預柱中得到富集，待溶劑流出后，柱溫箱開始進行程序升溫，目標物隨溫度增加而氣化進入分析柱中進行分離，在MS/MS檢測器中進行分析。根據40種有機磷農藥分子大小，利用分子較小的滅螨猛和分子較大的氟胺氰菊酯兩個標記物在凝膠色譜柱中的保留時間，確定目標餾分收集時間段3.83～5.83 min。該時間段內餾分通過PTV進樣，進入氣相色譜，依次進行全掃描和產物離子掃描，進而確定母離子和子離子，并對各目標化合物的多反應監(jiān)測(MRM)參數進行優(yōu)化[23]，具體參數見表1。如圖2所示，40種化合物得到有效分離和識別。

圖1 在線 GPC/GC-MS/MS示意圖Fig.1 Schematic flow diagram of online GPC/GC-MS/MS system

圖2 40種有機磷農藥基質匹配標準溶液的MRM總離子流色譜圖Fig.2 MRM total ion chromatogram of 40 organphosphorus pesticides matrix-matched standard solution the number denoted was the same as that in Table 1

表1 40種有機磷農藥的保留時間、監(jiān)測離子對和碰撞能量Table 1 Retention times,monitoring ions and collision energies of 40 organophosphorus pesticides

*quantitative ion pairs

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

大部分有機磷農藥極性較強，選用乙腈作提取溶劑時，不僅可以減少基質干擾物的溶出，而且能夠保證較好的提取效率[21,24-25]。本研究中茶葉經乙腈提取后離心，上清液中加MWCNTs凈化。MWCNTs比表面積大，對色素以及含平面結構的化合物有良好的吸附作用。實驗發(fā)現，隨著MWCNTs添加量的增大，對基質中色素的凈化效果顯著，但部分目標化合物也隨之被吸附，導致回收率偏低；通過在洗脫液中加入甲苯，可以降低MWCNTs對目標農藥的吸附，確保檢測的準確性[20]。實驗考察了MWCNTs對目標物的吸附及添加甲苯對回收率的影響。在陰性綠茶樣品中添加有機磷0.25 mg/kg，對1 mL乙腈提取液+1 mL甲苯與1 mL乙腈提取液+1 mL乙腈進行比較，分別考察了不同MWCNTs添加量(5、10、20、30、50 mg)時目標化合物的回收率。結果顯示，在添加乙腈條件下，有30種有機磷均隨著MWCNTs添加量的增加回收率顯著下降，而它們的結構中均含苯環(huán)或雜環(huán)；MWCNTs添加量為50 mg時，毒死蜱和殺螟硫磷等30種農藥的回收率均低于70%，其中有13種有機磷農藥的回收率不足20%。添加甲苯后，目標物回收率均得到提高。在30 mg MWCNTs添加量并添加甲苯的條件下，所有目標物回收率均大于80%，因此選擇該條件為實驗條件。

圖3 陰性綠茶樣品的全掃描總離子流圖Fig.3 Scan chromatograms of blank teaA：pretreated by TPT SPE column;B：pretreated by MWCNTs

2.3 兩種前處理方法的比較

研究中比較了SPE柱和DSPE兩種凈化方法。使用陰性綠茶樣品，DSPE凈化方法中加入30 mg MWCNTs為吸附劑，依據本文“1.2.2”步驟進行操作；SPE依據GB/T 23204-2008進行操作，即4 g樣品經8 mL乙腈重復提取2次，將提取液轉移至20 mL容量瓶中定容至刻度，取2.0 mL提取液經TPT固相萃取柱凈化，以乙腈-甲苯(3∶1)為洗脫液收集流出液約30 mL，將流出液濃縮至近干后，用正己烷定容至2.0 mL。結果表明，SPE對色素的凈化效果明顯，但GC-MS全掃描獲得的樣品總離子流圖顯示，經MWCNTs為吸附劑的DSPE方法凈化后基質干擾峰更少，如圖3所示。

在0.1 mg/kg加標濃度下，利用MWCNTs凈化后，測得40種有機磷農藥的回收率為87.7%～104%，相對標準偏差(RSDs)為0.7%～5.6%；TPT柱凈化方法的回收率除滅菌磷外均在82.4%～107.2%之間，RSDs為0.7%～11.0%，其中滅菌磷回收率僅為54%(RSD為16.3%)，原因是其被SPE柱吸附而未能得到有效洗脫。與SPE凈化方法相比，MWCNTs凈化可保證對滅菌磷的準確分析，此外DSPE凈化步驟在成本和操作上均具有優(yōu)勢。

2.4 方法學考察

依據“1.2.1”，采用空白基質進行標準曲線配制，以目標物的峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度(X，μg/L)為橫坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線，線性范圍如表2所示。40種有機磷農藥在對應的質量濃度范圍內均呈良好的線性關系，r2均不小于0.99。以色譜峰信噪比(S/N)≥3計算方法檢出限(LOD)，S/N≥10確定方法定量下限(LOQ)。對陰性綠茶樣品進行20、50、150 μg/kg 3個濃度水平的加標回收率實驗，結果見表2。

表2 40種有機磷農藥在茶葉中的加標回收率、相對標準偏差(n=6)、線性范圍、檢出限與定量下限Table 2 Spiked recoveries,relative standard deviations(RSDs),linear ranges,limit of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) for 40 organophosphorus pesticides spiked in tea(n=6)

(續(xù)表2)

實驗結果顯示，40種有機磷農藥的回收率為84.2%～109.9%，RSD為1.1%～8.9%，方法的準確度及精密度滿足實際檢測的要求。檢出限低至0.5～4.6 μg/kg，優(yōu)于同類文獻中1.5～20 μg/kg[17,26]的結果(如甲拌磷、殺螟硫磷的檢出限均低于相關文獻中結果值的4倍以上)。這是由于,一方面，在線GPC/GC-MS/MS可將進樣量增至10 μL，較傳統(tǒng)進樣方式提高了樣品量；另一方面，MRM模式較常用的選擇離子掃描模式降低了背景干擾，提高了檢測靈敏度。

2.5 實際樣品的檢測

采用本方法對50批茶葉樣品進行測定，其中有1批樣品檢出馬拉硫磷，2批樣品檢出毒死蜱，1批樣品檢出殺螟硫磷，其余樣品均未檢出。使用GB/T 23204-2008方法對4批陽性樣品進行驗證，檢測結果如表3所示，表明本方法對實際樣品的測定結果與現行標準相近。

表3 實際樣品的檢測結果Table 3 Detection results of the practical samples

3 結 論

本研究利用MWCNTs的DSPE凈化方法結合在線GPC/GC-MS/MS技術，建立了茶葉中40種有機磷農藥殘留量的檢測方法。研究結果顯示，在MWCNTs凈化過程中添加甲苯可提高相應農藥的回收率。通過比較SPE和DSPE兩種凈化方法，發(fā)現MWCNTs的凈化效果優(yōu)于使用TPT柱的SPE凈化方法。本方法前處理步驟簡單、操作便捷、靈敏度高，能夠滿足茶葉中痕量農藥殘留的檢測要求，從而為復雜基質中多農藥殘留的綠色檢測提供了新方向。

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