稀糖分罐發(fā)酵對L-色氨酸發(fā)酵的影響

劉子強,張 震,蔡萌萌,戶紅通,陳 寧,徐慶陽*

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室 天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室,天津300457)

色氨酸產(chǎn)業(yè)近幾年來發(fā)展迅猛,是因其在生命體生長發(fā)育和代謝系統(tǒng)中不可替代的重要作用而逐漸被人們開發(fā)利用［1-3］?，F(xiàn)在色氨酸在飼料添加劑、食品和醫(yī)藥方面都有非常廣泛的應(yīng)用［4-6］。色氨酸的生產(chǎn)方法也由剛開始的化學(xué)合成法、酶法、微生物轉(zhuǎn)化法到現(xiàn)在幾乎所有色氨酸產(chǎn)業(yè)都采用的微生物發(fā)酵法,因為其原材料易得、工藝步驟相對簡單,產(chǎn)量高,所以非常適合大規(guī)模生產(chǎn)［7-9］。雖然微生物發(fā)酵色氨酸產(chǎn)量高、效益好,但是在生產(chǎn)工藝方面仍然存在以下問題。

色氨酸發(fā)酵在工業(yè)上常采用65%的濃淀粉糖流加補料(實驗室采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的葡萄糖液進(jìn)行替代),淀粉糖在制作時遇高溫發(fā)生反應(yīng)使糖液顏色變深不僅導(dǎo)致培養(yǎng)基的碳源質(zhì)量降低,也給后續(xù)提取工作帶來困難。而且發(fā)酵中期時當(dāng)裝填系數(shù)達(dá)到一定程度后,操作人員會放出部分料液以維持發(fā)酵罐正常裝填系數(shù),放出的料液直接送往提取車間進(jìn)行產(chǎn)品提取。這時料液中還含有未利用的培養(yǎng)基和具備高產(chǎn)酸活力的菌體,提前將其放出會造成菌體活力的浪費,導(dǎo)致最終色氨酸產(chǎn)量降低。再有,濃糖補料的缺點在于不容易混合均勻,導(dǎo)致罐內(nèi)局部糖濃度分布不均,局部濃度過低會影響菌體正常生長,局部濃度過高則會使菌體合成副產(chǎn)物乙酸。乙酸濃度過高會抑制細(xì)胞生長及重組蛋白合成,制約著色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的進(jìn)一步提升［10］。這些都一定程度上制約著發(fā)酵生產(chǎn)。

為了解決以上存在的問題,本研究在現(xiàn)有的發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上對發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化,利用稀濃度葡萄糖糖液(簡稱為稀糖)流加發(fā)酵,降低成本損耗,減少色素雜質(zhì)的添加；發(fā)酵中期對發(fā)酵液重新分配,將部分料液轉(zhuǎn)入其他罐中進(jìn)行發(fā)酵,避免中期放料,減少菌體和培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的浪費,提高設(shè)備利用率；以期為色氨酸發(fā)酵和工業(yè)化生產(chǎn)提供新的工藝思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

L-色氨酸工程菌大腸桿菌(Escherichiacoli)TRTH：天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基［11-13］

種子培養(yǎng)基：葡萄糖35 g/L,酵母粉2 g/L,一水合檸檬酸1.6 g/L,硫酸銨1.2 g/L,磷酸氫二鉀5.6 g/L,七水合硫酸鎂1.6 g/L,維生素B1(vitamin B1,VB1)1.3 mg/L,七水合硫酸亞鐵2.8 mg/L,一水合硫酸錳1.2 mg/L,生物素(vitamin H,VH)2 mg/L,鹽酸四環(huán)素50 mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L,酵母粉2 g/L,一水合檸檬酸2 g/L,硫酸銨1.6 g/L,磷酸氫二鉀7.5 g/L,七水合硫酸鎂2 g/L,七水合硫酸亞鐵75 mg/L,維生素B族混合物(VB1、VB3、VB5、VB7)0.1 mL/L,微量元素混合物1 mL/L。

1.1.3 化學(xué)試劑

L-色氨酸：北京索萊寶科技有限公司；對二甲氨基苯甲醛：上海三愛思試劑有限公司；亞硝酸鈉：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；硫酸：天津化學(xué)試劑二廠；一水合葡萄糖：西王藥業(yè)有限公司鄒平分公司；酵母粉：英國OXOID公司；一水合檸檬酸、一水合硫酸錳：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、七水合硫酸亞鐵：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；生物素(VH)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸四環(huán)素：上海麥克林生化科技有限公司；DF-8016生物發(fā)酵專用消泡劑：東莞市德豐消泡劑有限公司。實驗室所用化學(xué)試劑均為分析純及生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250-A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；TG16-W微量臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；30 L在位滅菌發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；KQ-C型全自控蒸汽發(fā)生器：上海奉賢協(xié)新機電廠；LC-20A高效液相色譜儀(high performanceliquid chromatograph,HPLC)：島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 稀糖分罐發(fā)酵工藝流程

本工藝采用三罐一組進(jìn)行分罐發(fā)酵,罐A、罐B接種后在發(fā)酵前期仍采用現(xiàn)有發(fā)酵方式(葡萄糖濃糖流加,糖液濃度為80%)進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵至中期(發(fā)酵時間為20 h前后)時,將罐A和罐B兩罐1/3料液打入已消毒的罐C中,實現(xiàn)料液分罐；分罐結(jié)束后流加糖濃度為40%的稀糖繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵,實現(xiàn)稀糖補料。具體操作要點如下：

首先將菌種擴(kuò)培接到5 L種子罐中進(jìn)行種子發(fā)酵,發(fā)酵約10 h,在此期間將A、B兩個30 L發(fā)酵罐在位空消,滅菌條件為121℃、20 min,加入發(fā)酵培養(yǎng)基并加水定容至15 L后在位實消,滅菌條件為115℃、15 min；待種子罐菌液菌體濃度OD600nm值處于10～12區(qū)間時接入已在位實消好的30 L發(fā)酵罐A和B中,保持36.8～37℃發(fā)酵,接菌量為10%。這時需要將罐C在位空消,滅菌條件為121℃、20 min,在溫度還未下降時通入無菌空氣,保持罐處于正壓狀態(tài)；當(dāng)發(fā)酵中期發(fā)酵液體積(將攪拌和通氣因素考慮在內(nèi))超過發(fā)酵罐容積的80%后,將罐A和罐B中的1/3料液經(jīng)過無菌管道利用壓力差打入30 L發(fā)酵罐C中,三罐所流加的糖濃度均為40%的稀糖,繼續(xù)發(fā)酵。分罐發(fā)酵工藝流程示意圖如圖1。

圖1 稀糖分罐發(fā)酵工藝流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of fermentation process of diluted glucose with multiple fermenters

1.3.2 L-色氨酸發(fā)酵培養(yǎng)方法［14-15］

5 L發(fā)酵罐一級種子培養(yǎng)：在無菌環(huán)境下取適量無菌生理鹽水于6支活化好的斜面中,于37℃培養(yǎng)12 h,菌液打散后接入裝有4 L種子培養(yǎng)基的5 L自動數(shù)控發(fā)酵罐中,初始通氣量為1 L/min,初始攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min,通過數(shù)控自動流加25%氨水維持罐內(nèi)系統(tǒng)pH在7.0～7.2,培養(yǎng)溫度維持在36.8～37.0℃,通過一定脈沖比流加消泡劑消泡；當(dāng)培養(yǎng)菌體濃度的OD600nm值為10～12時,即可接入發(fā)酵培養(yǎng)基。

30 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：在30 L發(fā)酵罐中以10%接菌量接入15 L發(fā)酵培養(yǎng)基中,初始通風(fēng)量2 L/min,初始轉(zhuǎn)速300L/min,培養(yǎng)溫度36.8～37.0℃,通過數(shù)控自動流加25%氨水維持罐內(nèi)系統(tǒng)pH在7.0～7.2,通過一定脈沖比流加消泡劑消泡；當(dāng)罐內(nèi)系統(tǒng)糖濃度＜0.1%時,以適當(dāng)脈沖將液糖流加進(jìn)罐內(nèi),維持罐內(nèi)糖濃度≤0.1%；在發(fā)酵周期內(nèi)對發(fā)酵液每2 h取樣一次測定其菌體OD600nm值、生物量、L-色氨酸產(chǎn)量,并記錄發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)pH、OD600nm值、溫度、通風(fēng)、料液體積以及糖液流加量等其他參數(shù),直至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.3 檢測方法

pH的測定：采用pH 6.4～8.0的精密pH試紙及發(fā)酵罐附帶的pH電極進(jìn)行測定。

溶氧值測定：利用發(fā)酵罐附帶的溶氧電極測定發(fā)酵過程的溶氧水平。

菌體濃度測定：吸取適量發(fā)酵液稀釋至適當(dāng)倍數(shù),測定其在波長600 nm處的吸光度值,以吸光度值為0.2～0.9最佳,即吸光度值×稀釋倍數(shù)即為菌體濃度。

菌體生物量測定［16］：菌體生物量以菌體干質(zhì)量表示,取10 mL發(fā)酵液,10 000 r/min離心20 min,將菌體用蒸餾水洗滌2次后置于真空干燥箱中,80℃干燥至恒質(zhì)量,用分析天平稱質(zhì)量,重復(fù)3次取平均值。

L-色氨酸含量測定：采用對二甲氨基苯甲醛法［17］,在比色管中加入1 mL(1 g/L)L-色氨酸溶液(或已處理好的發(fā)酵液)與9 mL(3 g/L)對二甲氨基苯甲醛溶液,混合后在沸水中加熱2min,然后加入1滴亞硝酸鈉溶液,再繼續(xù)加熱3min,隨后取出用冷水浴冷卻,以試劑作空白,在波長600nm處測定其吸光度值。以L-色氨酸含量(C)為縱坐標(biāo),吸光度值(A)為橫坐標(biāo),得到L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線方程：C=23.56A,相關(guān)系數(shù)為R2=0.997 2,將發(fā)酵液樣品的吸光度值代入該工作曲線方程,即可得出發(fā)酵液中L-色氨酸的含量。乙酸含量的測定：采用高效液相色譜儀檢測發(fā)酵液中乙酸的含量［18］。發(fā)酵液預(yù)處理：取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中,13000r/min離心2min,取上清液稀釋10倍,然后用0.22μm微孔濾膜過濾,置于4℃冰箱中待測。

色譜條件：色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm,9μm),0.05 mol/L硫酸緩沖液洗脫,柱溫30℃,流速0.5 mL/min,檢測波長210 nm。

發(fā)酵液中葡萄糖及谷氨酸含量測定：利用生物傳感分析儀測定發(fā)酵液中的葡萄糖、谷氨酸含量。取發(fā)酵液1 mL于1.5 mL離心管中,13 000 r/min離心2 min,取10μL上清液于990μL去離子水中,稀釋100倍,用50μL進(jìn)樣針取25μL稀釋液進(jìn)樣檢測后直接讀數(shù)即為所測樣品含量［18］。

L-色氨酸發(fā)酵整個發(fā)酵周期的糖酸轉(zhuǎn)化率計算公式如下：

式中：L-色氨酸含量為發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液內(nèi)的L-色氨酸含量,g/L；發(fā)酵液體積為發(fā)酵結(jié)束時該罐內(nèi)所得發(fā)酵液體積,L；耗糖量為直至發(fā)酵結(jié)束時所流加總糖液核算后(除去葡萄糖所含結(jié)晶水和溶劑水)所得的純葡萄糖量,g。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀糖分罐發(fā)酵對菌體生物量及L-色氨酸產(chǎn)量的影響

為了驗證稀糖分罐發(fā)酵工藝的可行性和最終的生產(chǎn)效果,本研究利用5 L全自動發(fā)酵罐培養(yǎng)一級種子、30 L自動數(shù)控發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵試驗,在30 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中每隔2 h測定發(fā)酵液中菌體干質(zhì)量和L-色氨酸產(chǎn)量結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵工藝對菌體生物量(A)和L-色氨酸產(chǎn)量(B)的影響Fig.2 Effect of fermentation process on mycelia biomass(A)and L-tryptophan yield(B)

在發(fā)酵時間為20h時進(jìn)行分罐操作,此時罐A發(fā)酵液體積為18.2 L、罐B發(fā)酵液體積為18.8 L；利用壓力差分別將罐A和罐B中的發(fā)酵液均分到已經(jīng)準(zhǔn)備好的罐C中,三罐同時繼續(xù)開始發(fā)酵,控制糖流加速率保持不變,但所流加的糖濃度由80%改為40%。

由圖2A可知,在分罐前后菌體生物量的增長速率沒有明顯變化,菌體由濃糖流加變?yōu)橄√呛髱缀醪恍枰m應(yīng)就能正常生長,最終積累的生物量稍高于普通發(fā)酵工藝,最高達(dá)到了44.84 g/L,三罐平均生物量為44.31 g/L,較普通工藝增長了5.4%。且本工藝中菌體對數(shù)生長期要比傳統(tǒng)發(fā)酵工藝長2 h左右,這表明稀糖分罐發(fā)酵工藝有利于菌體生長,且拉長了菌體對數(shù)生長期。這在工業(yè)生產(chǎn)中有一定推廣價值。在工業(yè)生產(chǎn)中,由于發(fā)酵罐容積很大,補料通常采用罐頂單路流加補料,使用濃糖流加雖然可以避免由于補料增加發(fā)酵液體積,但很容易導(dǎo)致罐內(nèi)料液混勻過慢造成糖濃度分布不均。局部糖濃度過高導(dǎo)致菌體乙酸大量產(chǎn)出,抑制菌體生長,使產(chǎn)量下降；而罐底等部分糖濃度過低,菌體缺乏碳源,處于高溶氧狀態(tài),使菌體易老化,產(chǎn)酸速率降低,糖酸轉(zhuǎn)化率下降。而采用稀糖發(fā)酵就可以在一定程度上減輕上述情況對發(fā)酵造成的影響。

由圖2B可知,從產(chǎn)量方面看,稀糖分罐發(fā)酵三罐的L-色氨酸產(chǎn)量基本相同,其中罐B終產(chǎn)量最高,為44.1 g/L；三罐平均產(chǎn)量為43.82 g/L。菌體在10～28 h時產(chǎn)L-色氨酸水平較高。發(fā)酵后期產(chǎn)酸速度緩慢,單批次平均最終產(chǎn)量較普通發(fā)酵增長了9.9%；普通發(fā)酵最終的色氨酸產(chǎn)量為39.88 g/L,菌體28 h后產(chǎn)酸進(jìn)入停滯期,發(fā)生這種情況的原因是普通發(fā)酵在發(fā)酵中后期由于乙酸的積累抑制了菌體的生長,且使菌體活力大大下降,導(dǎo)致了產(chǎn)酸停滯期過早的出現(xiàn)。稀糖分罐發(fā)酵工藝在初始培養(yǎng)基體積不變、補糖速率不變的情況下分罐后采用低濃度的糖補料,勢必就會增加發(fā)酵液的體積,這樣不僅有利于菌體對氧的吸收,還可以有效稀釋發(fā)酵液中副產(chǎn)物乙酸的含量,有研究表明,當(dāng)乙酸含量＞2 g/L時,菌體的生長就會受到抑制［10］。所以稀糖補料可以一定程度上降低乙酸積累對于菌體的毒害,從而使得菌體在發(fā)酵后期仍具有產(chǎn)酸活力。

2.2 稀糖分罐發(fā)酵對發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸積累的影響

色氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)時主要的副產(chǎn)物有乙酸、乳酸、谷氨酸等［1］,其中對菌體生長影響最顯著的是乙酸的積累。本試驗研究了發(fā)酵液樣品中副產(chǎn)物乙酸的積累量與發(fā)酵培養(yǎng)時間的關(guān)系,并將新工藝與普通發(fā)酵作對比,結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵工藝對乙酸積累量的影響Fig.3 Effect of fermentation process on accumulation of acetic acid

由圖3可知,在發(fā)酵進(jìn)行到18h之后乙酸開始大量生成,這是由于隨著菌體生物量的增加,發(fā)酵液內(nèi)的菌體密度不斷增大,菌體不能及時攝取到足夠的氧氣導(dǎo)致底物通過乙酰磷酸途徑轉(zhuǎn)化為乙酸,最終稀糖發(fā)酵工藝和普通發(fā)酵工藝乙酸積累量分別為3.66 g/L和6.06 g/L,副產(chǎn)物乙酸積累量降低了65.5%。這是由于在采用稀糖流加培養(yǎng)以后,稀糖的流加逐漸稀釋了發(fā)酵液內(nèi)乙酸的含量,從而乙酸對菌體的生長抑制和毒害作用得到了一定緩解；此外由于稀糖流加的稀釋作用使得菌體更容易攝取氧氣,這在一定程度上也減緩了菌體合成乙酸。結(jié)果表明,采用稀糖發(fā)酵工藝可有效緩解副產(chǎn)物乙酸對菌體帶來的毒害和抑制,從而有利于L-色氨酸產(chǎn)量的提高。

2.3 稀糖分罐發(fā)酵對L-色氨酸發(fā)酵工藝糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

稀糖分罐發(fā)酵工藝是將相同控制條件的兩個罐內(nèi)的部分發(fā)酵液在同一時刻打入另外一個相同容積的發(fā)酵罐內(nèi),之后均采用稀糖流加補料方式繼續(xù)發(fā)酵,并與普通發(fā)酵進(jìn)行對比,檢測各罐發(fā)酵液參數(shù),結(jié)果如表1所示。

表1 不同發(fā)酵工藝參數(shù)結(jié)果對比Table 1 Comparison of different fermentation process parameters results

根據(jù)表1中所列各罐參數(shù),最終可核算出每罐最終糖酸轉(zhuǎn)化率以及合計后的平均糖酸轉(zhuǎn)化率,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,罐A、B、C以及普通發(fā)酵罐的最終糖酸轉(zhuǎn)化率分別為19.8%、20.8%、19.7%和17.8%。稀糖發(fā)酵工藝合計后平均糖酸轉(zhuǎn)化率為20%,比普通發(fā)酵工藝提高了12.36%。由此可知,稀糖分罐發(fā)酵工藝在一定程度上可以降低工藝成本、提高菌體利用率和糖酸轉(zhuǎn)化率,從而在工業(yè)生產(chǎn)上具有一定推廣價值。

圖4 不同發(fā)酵工藝條件下的糖酸轉(zhuǎn)化率Fig.4 Glucose acid conversion rate of under different fermentation process

3 結(jié)論

采用稀糖分罐發(fā)酵工藝,研究了在該工藝條件下稀糖分罐發(fā)酵對色氨酸發(fā)酵過程中菌體生物量、L-色氨酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率以及副產(chǎn)物乙酸積累量的影響。結(jié)果表明,采用稀糖分罐發(fā)酵工藝,單批次平均菌體生物量、L-色氨酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率分別為44.31 g/L、43.82 g/L、20%,較普通工藝分別提高了5.4%、9.9%和12.36%,可以有效提高色氨酸產(chǎn)品的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率；乙酸積累量為3.66 g/L,較普通工藝下降65.5%,說明利用稀糖流加補料可以稀釋發(fā)酵液中的乙酸濃度,減少其對菌體的毒害作用；采用稀糖分罐發(fā)酵工藝,可以避免發(fā)酵中期排料,避免了菌體活力的浪費,提高了菌體利用率；采用稀糖分罐發(fā)酵工藝,在一個發(fā)酵周期內(nèi)可利用一套種子培養(yǎng)系統(tǒng)供應(yīng)三個發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵,收獲發(fā)酵液總產(chǎn)酸量達(dá)到了2 274.3 g,是相同發(fā)酵周期內(nèi)普通工藝酸量的2.9倍,節(jié)省了設(shè)備和原材料成本,提高了設(shè)備利用率和工作效率,也減輕了工作量。在工業(yè)生產(chǎn)方面有一定實用性和推廣價值。

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《中國釀造》雜志廣告征訂啟事

《中國釀造》創(chuàng)刊于1982年,是由中國商業(yè)聯(lián)合會主管,中國調(diào)味品協(xié)會及北京食品科學(xué)研究院主辦的綜合性科技月刊(國內(nèi)統(tǒng)一刊號CN 11-1818/TS,國際標(biāo)準(zhǔn)刊號ISSN 0254-5071,廣告許可證號：京宣工商廣字第0033號)。全國各地郵局均可訂閱,郵發(fā)代號：2-124；國外總發(fā)行：中國國際圖書貿(mào)易總公司,國外發(fā)行代號：BM1437?！吨袊勗臁窔v次被評為全國中文核心期刊、中國科技核心期刊、《中國知網(wǎng)》重點收錄期刊、《萬方數(shù)據(jù)庫》全文收錄期刊、《中文科技期刊數(shù)據(jù)庫》來源期刊、中國學(xué)術(shù)期刊網(wǎng)絡(luò)出版總庫收錄期刊、美國《烏利希期刊指南》(UPD)收錄期刊、英國《食品科學(xué)文摘》(FSTA)收錄期刊、英國《國際農(nóng)業(yè)與生物科學(xué)研究中心》(CABI)收錄期刊、美國《化學(xué)文摘》(CA)收錄期刊、俄羅斯《文摘雜志》(AJ)收錄期刊、中國科學(xué)評價研究中心(RCCSE)數(shù)據(jù)庫收錄期刊,也是學(xué)位與研究生教育的中文重要期刊。

《中國釀造》重點報道調(diào)味品、釀酒、食品微生物、食品添加劑、發(fā)酵乳制品、生物工程技術(shù)、生物化工、生物質(zhì)能源的開發(fā)利用等研究方向的新工藝、新技術(shù)、新設(shè)備、分析檢測、安全法律法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)、保鮮與貯運技術(shù)、綜合利用、質(zhì)量保障體系等方面的基礎(chǔ)理論、應(yīng)用研究及綜述文章。設(shè)有“研究報告”、“專論綜述”、“創(chuàng)新借鑒”、“經(jīng)驗交流”、“分析檢測”、“產(chǎn)品開發(fā)”、“釀造文化”、“海外文摘”等欄目。

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