卡那霉素單克隆抗體制備以及化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的研制

萬宇平,彭慶軍,于海浪,鄭迎春,賈芳芳,馮月君

(1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司,北京 102206；2.北京市門頭溝區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心,北京 102308；3.江蘇益客食品集團有限公司,江蘇 南京 210000；4.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心,北京 102206)

卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素,經(jīng)常用于治療由革蘭氏菌引起的感染,由于卡那霉素殺菌具有高效性和廣譜性,因此在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛,常常導(dǎo)致動物源性食品中抗生素的過度殘留,通過富集作用進入人體,可能會引起一定程度的耳毒性［1-5］。

化學(xué)發(fā)光免疫分析法是利用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。一般情況下,化學(xué)發(fā)光免疫分析儀包含兩個部分,即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。前者是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個激發(fā)態(tài)的中間體,當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時,同時發(fā)射出光子,利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產(chǎn)額。后者是將發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記在抗原或抗體上,或酶作用于發(fā)光底物。

目前,測定卡那霉素有微生物法、高效液相色譜、傳感器法、酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinked immunosorbentassay,ELISA)等［6-12］?；瘜W(xué)發(fā)光檢測方法［13-15］的自動化程度較高,操作簡便,優(yōu)于以上三種方法,其配套儀器化學(xué)發(fā)光儀能夠同時檢測多種樣本,檢測速度可達(dá)到150樣本/h,對單一樣本可同時檢測15個項目,檢測靈敏度達(dá)到0.01μg/L,能夠充分發(fā)揮國產(chǎn)試劑和儀器的成本優(yōu)勢,更加適宜于基層實驗室的大批量樣本檢測,不必在物力和人力二者之間進行兩難選擇,對于食品安全檢測環(huán)節(jié)具有實際意義。本研究應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測原理,制備出檢測牛奶和奶粉中卡那霉素的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒,以期為基層實驗室提供優(yōu)質(zhì)選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：59-01-8)：北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；鄰苯二甲酸酐、吡啶、乙醇、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、魯米諾：北京百欣試劑公司；牛奶和奶粉：市售；發(fā)光底物液、復(fù)溶工作液、小鼠脾細(xì)胞：北京勤邦生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HMC-D2全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀：北京勤邦生物技術(shù)有限公司；MX-F渦旋儀：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備抗原

(1)半抗原的制備

將1.0 g卡那霉素、0.3 g鄰苯二甲酸酐和2 mL吡啶加入至10 mL二甲基甲酰胺(dimethylformamide,DMF)中,形成混合液,室溫下,攪拌反應(yīng)12 h,通過減壓蒸除溶劑,在乙醇中重結(jié)晶,得到鄰苯二甲酸單卡那霉素酰胺(卡那霉素有4個活性氨基,但是最活潑的是與鄰苯二甲酸酐連接的氨基,通過降低溫度(室溫反應(yīng)),降低鄰苯二甲酸酐用量,來控制上那最活潑的氨基上),卡那霉素半抗原的合成路線見圖1。得到半抗原產(chǎn)物質(zhì)量0.69 g,得率53%,其計算公式如下：

圖1 卡那霉素半抗原合成路線Fig.1 Synthesis route of kanamycin hapten

(2)免疫原的制備

取20mg鄰苯二甲酸單卡那霉素酰胺,溶解于1mLDMF中,取30 mg碳二亞胺(carbodiimide,EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS),用0.2 mL水充分溶解后加至鄰苯二甲酸單卡那霉素酰胺溶解液中,室溫下攪拌24h,即可得到反應(yīng)液A。稱取50mg牛血清白蛋白(BSA),使之充分溶解在3.8 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(pH 7.2)中,將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到該蛋白溶液中,并于室溫條件下攪拌24h,用0.01mol/LPBS 4℃透析3 d,每天換3次透析液,目的是除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。得到的免疫原保存于-20℃。

(3)包被原的制備

參照免疫原的制備方法,除所用蛋白為卵清蛋白外,其他操作均相同。

1.3.2 制備單克隆抗體、酶標(biāo)記抗原

將1.3.1得到的卡那霉素免疫原依次進行動物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選、單克隆抗體制備等操作［16］,最終得到卡那霉素單克隆抗體。

稱取2 mg辣根過氧化物酶［17］溶解于0.5 mL雙蒸水中；加入0.5 mL新配制的0.06 mol/L NaIO4溶液,4℃避光作用30 min；加入160 mmol/L的乙二醇0.5 mL,室溫作用30 min；加入卡那霉素-OVA 2 mg,混勻后裝入處理過的透析袋中,置1 000 mL的0.05 mmol/L碳酸鈉緩沖液中透析,4℃過夜；透析液吸至10 mL的離心管中,加0.25 mL新配的5 g/L NaBH4液,混勻后置4℃2 h；加入等體積的飽和硫酸銨溶液,4℃作用30min,在4℃條件下3000 r/min離心25min,棄上清；將沉淀溶于1.5 mL 0.02 mol/L pH 7.4 PBS中,吸入透析袋內(nèi),在0.02 mol/L pH 7.4 PBS透析,4℃過夜(中途更換PBS3次)；將透析液中液體吸至微量離心管中,4℃條件下10000r/min離心30min,將上清液吸出,加等量甘油,混勻,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 試劑盒檢測方法

全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀通過測定卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量濃度依次為0、0.05μg/L、1.05μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、2.70μg/L)發(fā)光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀主菜單進入測試要求屏幕；在試劑區(qū)設(shè)置試劑盒的位置；標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)、樣品區(qū)分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品和樣品位置；按下運行鍵開始檢測；系統(tǒng)會自動計算檢測結(jié)果。

1.3.4 牛奶和奶粉樣本的前處理方法

取50μL鮮牛奶樣本于8 mL玻璃試管中加950μL復(fù)溶工作液,渦動混勻。

稱取(0.50+0.05)g奶粉樣本,加入2.5 mL復(fù)溶工作液,渦動混勻；取300μL于8 mL玻璃試管中加入900μL復(fù)溶工作液,渦動混勻。

1.3.5 檢測性能

(1)計算檢測限

分別檢測20份牛奶和奶粉空白樣本,利用空白樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差,計算檢測限(limitof detection,LOD),即最低被測物濃度［16］。

(2)精密度和準(zhǔn)確度

我國國家標(biāo)準(zhǔn)《動物源食品中獸藥殘留限量》中規(guī)定了雞肉中卡那霉素的最大殘留限量為100μg/kg［17］。目前暫無化學(xué)發(fā)光試劑盒相關(guān)文件,因此參考《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定,即當(dāng)試劑盒檢測有最高殘留限量(maximum residuelimit,MRL)的藥物時,測定回收率的添加濃度分別為0.5×MRL、1×MRL和2×MRL(或1.5×MRL)。因此,本研究按照上述要求,分別對牛奶樣本添加卡那霉素,使其質(zhì)量濃度達(dá)到50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg,測定加標(biāo)回收率,以此評價該試劑盒的準(zhǔn)確度。同時,每個樣本做4個平行,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD),以此評價該試劑盒的精密度。

(3)測定穩(wěn)定性

將試劑盒放置于4℃保存,每月測定一次牛奶樣本的回收率和半抑制濃度(50%inhibiting concentration,IC50),連續(xù)測定12個月。

(4)測定抗體特異性

鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素與卡那霉素的結(jié)構(gòu)類似［18］,測定這三種藥物的IC50,根據(jù)下式計算該試劑盒對于鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素的交叉反應(yīng)率：

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定半抗原

利用核磁共振氫譜法測定1.3.1制備的半抗原,如圖2所示,8.0 mg/kg左右的芳香烴信號和11.0 mg/kg羧基峰信號的出現(xiàn)說明半抗原合成成功［19-20］。

圖2 卡那霉素半抗原核磁共振氫譜Fig.2 HNMR of the kanamycin hapten

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀通過測定卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量濃度依次為0、0.05μg/L、1.05μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、2.70μg/L)發(fā)光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖3。

圖3 卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of kanamycin

由圖3可知,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.082 4x-1.341 0,R2=0.996 7,線性范圍為0～2.70μg/L,檢測靈敏度為0.05μg/kg,IC50(半抑制濃度)值為0.305μg/L。

2.3 計算檢測限

20個牛奶空白樣本中卡那霉素的檢測結(jié)果見表1。檢測限以測定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差計算。

表1 牛奶空白樣本檢測限測定結(jié)果Table 1 Detection limit results of milk blank samples

表2 奶粉空白樣本檢測限測定結(jié)果Table 2 Detection limit results of milk powder blank samples

由表1、表2可知,20個牛奶樣本中卡那霉素的測定結(jié)果平均值為0.35μg/kg,RSD為0.18%,檢測限為0.89μg/kg；20個奶粉樣本中卡那霉素的測定結(jié)果平均值為0.34μg/kg,RSD為0.20%,最低檢測限為0.95μg/kg。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

測定添加不同質(zhì)量濃度卡那霉素的牛奶樣品的精密度及準(zhǔn)確度試驗結(jié)果見表3。

表3 牛奶樣品精密度及準(zhǔn)確度試驗結(jié)果Table 3 Precision and accuracy tests results of milk samples

由表3可知,回收率范圍是80.6%～105.6%,當(dāng)添加質(zhì)量濃度分別為50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg時,批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是3.0%～9.2%；批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是6.5%～7.7%?？梢?批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜10%,試劑盒精密度及準(zhǔn)確度良好。

2.5 測定穩(wěn)定性

將試劑盒保存在4℃,每月測定IC50值和回收率,穩(wěn)定性結(jié)果見表4。由表4可知,測定無添加卡那霉素試劑盒的半數(shù)抑制濃度范圍是0.25～0.37μg/L,卡那霉素添加回收率范圍是80.5%～103.8%,由此可見,各指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)。該試劑盒在4℃至少能夠保存12個月。

表4 試劑盒在4℃保存的穩(wěn)定性Table 4 Stability of the kit kept at 4℃

2.6 抗體特異性的測定

卡那霉素抗體與鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素的交叉反應(yīng)率見表5。

表5 交叉反應(yīng)率試驗結(jié)果Table 5 Results of cross reaction rate tests

由表5可知,卡那霉素抗體與鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素的交叉反應(yīng)率分別為7.1%、9.0%、4.6%,交叉反應(yīng)率低,由此可見,卡那霉素抗體特異性良好。

2.7 討論

在快速檢測方法的文獻中,利用酶聯(lián)免疫方法檢測卡那霉素居多,說明ELISA方法在該領(lǐng)域應(yīng)用比較成熟,而化學(xué)發(fā)光檢測方法尚未廣泛應(yīng)用于快速檢測行業(yè),本研究具有一定的參考價值。裴道國等［21］研究的ELISA試劑盒對動物源性食品中卡那霉素的檢測限為10μg/kg,本研究檢測限為0.89μg/kg。

3 結(jié)論

本研究制備了抗卡那霉素單克隆抗體,并研發(fā)出相應(yīng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒,試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍0～2.70μg/L,對奶粉的檢測限為0.95μg/kg,對牛奶的檢測限為0.89μg/kg,對牛奶的回收率為80.6%～105.6%,批內(nèi)RSD范圍是3.0%～9.2%,批間RSD范圍是6.5%～7.7%。特異性方面良好,卡那霉素單克隆抗體與鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素的交叉反應(yīng)率分別為7.1%、9.0%、4.6%?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒能夠在4℃條件下保存12個月,IC50值和回收率指標(biāo)均在正常范圍內(nèi),穩(wěn)定性較好［22］。

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