甘薯病毒病脫毒技術(shù)的研究進(jìn)展

何毅文 ，陳珠 ，李育軍 ，何夢海 ，張雄堅(jiān) ，植石燦 ，，沈文杰 ，秦樹香 ，，章楷煜 ，倪喬丹

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州，510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江分院；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院；4.深圳市河田姆生物農(nóng)業(yè)創(chuàng)新有限公司；5.湛江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）

甘薯以營養(yǎng)繁殖方式繁衍后代，感染病毒后，病毒便不斷蔓延，最終導(dǎo)致種性退化。據(jù)調(diào)查，甘薯病毒病導(dǎo)致減產(chǎn)25%左右，有的品種減產(chǎn)達(dá)50%以上[1]。目前，國內(nèi)外還沒有有效防治甘薯病毒病的特定農(nóng)藥，也無高抗病毒病的甘薯品種，因此，利用甘薯脫毒苗是防治甘薯病毒病唯一比較有效的途徑。

1 試管苗培育技術(shù)

1.1 試管苗培育歷史概況

植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展大概經(jīng)歷了以下3個(gè)階段：①探索階段（1902-1929年）。19世紀(jì)初國外科學(xué)家利用植物的細(xì)胞、胚、器官等組織進(jìn)行了不同嘗試；1922年，美國醫(yī)學(xué)家Robbins和德國科學(xué)家Kotte率先報(bào)道離體培養(yǎng)根尖取得了成功。②組織培養(yǎng)技術(shù)理論的建立與發(fā)展階段 （1930-1959年）。1934年美國科學(xué)家懷特等用番茄的根進(jìn)行組織培養(yǎng)，首次建立了生長旺盛的無性繁殖系，隨著探究的不斷深入，法國科學(xué)家Nobecourt建立了使離體植物組織在人工培養(yǎng)基上不斷生長的培養(yǎng)物，奠定了現(xiàn)代組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)。③快速發(fā)展和實(shí)踐應(yīng)用階段（1960年以來至今）。20世紀(jì)初該項(xiàng)技術(shù)建立以來，在理論研究和應(yīng)用技術(shù)上不斷發(fā)展，在植物的快速繁殖、品種改良、種質(zhì)資源保存等方面應(yīng)用廣泛[2]；日本學(xué)者中島和山口于1968年率先進(jìn)行甘薯組織培養(yǎng)研究，并成功利用離體細(xì)胞培養(yǎng)出愈傷組織，由此開啟了組織培養(yǎng)技術(shù)在甘薯上的應(yīng)用[3]。

1.2 試管苗培育方法進(jìn)展

①培養(yǎng)基上的研究新進(jìn)展 傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)技術(shù)要求操作環(huán)境無菌，操作過程滅菌，因而傳統(tǒng)的方法只適用于實(shí)驗(yàn)室且需要專業(yè)人士嚴(yán)格把控，無形中增加了實(shí)驗(yàn)成本，不利于技術(shù)推廣。隨著研究人員對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)、環(huán)境適應(yīng)性的深入研究，提出增加CO2濃度代替糖作碳源，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入抗菌劑、抑菌劑等物質(zhì)，簡化了植物組織培養(yǎng)工作，而且提高了組培苗的成活率和生長發(fā)育速度[2，4]。

②光源上的研究新進(jìn)展 光是影響植物生長的重要因素之一。近年來，在光源方面出現(xiàn)了諸多報(bào)道，其中關(guān)于LED燈的研究最為火熱。LED燈具有體積小、耗電量低、壽命長、高亮度、低熱量等優(yōu)點(diǎn)，因而被人們應(yīng)用于生產(chǎn)、生活等方面，研究發(fā)現(xiàn)其在節(jié)能和促進(jìn)植物生長方面也有明顯的優(yōu)勢[5]。但LED燈含有多種有毒元素，廢舊的LED燈處理不當(dāng)會(huì)危害環(huán)境，此外其發(fā)出的藍(lán)光和UV（紫外光）對人體具有一定危害。除LED燈之外，SILHOS和CCFL等新型光源也將是發(fā)展的主流。

③與其他技術(shù)相結(jié)合 a.與細(xì)胞融合技術(shù)相結(jié)合。植物體細(xì)胞雜交是將不同科、屬、種間的原生質(zhì)體通過人工誘導(dǎo)融合再培養(yǎng)，創(chuàng)造出新的優(yōu)良品種的技術(shù)[6]。利用甘薯品種間體細(xì)胞融合產(chǎn)生的新品種，為甘薯育種提供了新方法[7]。

b.與輻射技術(shù)相結(jié)合，篩選有利變異體。細(xì)胞在分裂過程中受外界如輻射等影響，往往會(huì)發(fā)生突變，產(chǎn)生變異，可從中篩選出有利變異體，應(yīng)用于生產(chǎn)。20世紀(jì)末陸漱韻等[8]選用浙60-2、徐薯、栗子香3個(gè)品種進(jìn)行輻射，初步獲得對線蟲性糠腐病抗擴(kuò)展的變異系。

隨著人們對組培的多角度研究，多因子綜合控制技術(shù)逐漸被應(yīng)用，該項(xiàng)技術(shù)有效降低了生產(chǎn)成本，使組培苗商品化成為可能[4]。

2 甘薯病毒病發(fā)生概況及種類介紹

2.1 甘薯病毒病發(fā)生概況

自1919年報(bào)道甘薯病毒病以來，世界各地相繼報(bào)道了甘薯病毒病的發(fā)生。我國甘薯種植面積大，甘薯病毒病發(fā)病率普遍較高，部分品種甚至達(dá)90%以上[9]。田間環(huán)境復(fù)雜，暴發(fā)的甘薯病毒病往往為復(fù)合侵染型，因此，有關(guān)甘薯病毒病的報(bào)道中對其名稱及癥狀的描述較為混亂。直到1974年以后，才有部分病毒被純化鑒定出來，但甘薯病毒病的許多病原至今仍不清楚，有關(guān)已分離出的幾種病毒分子的研究成果也不多。截至2011年，在甘薯中發(fā)現(xiàn)病毒近30種[10]；至2012年，我國甘薯上已確定至少存在8種病毒，但由于缺乏甘薯病毒種類鑒定系統(tǒng)，因而還有多種尚不確定[11]。

2.2 甘薯病毒病的種類介紹

2016年2月6日，我國學(xué)者張振臣在邯鄲市“第三屆中原脫毒甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展研討會(huì)”上，對甘薯病毒病的識(shí)別及綜合防控技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)。他認(rèn)為，目前世界上已公開的甘薯病毒有32種，我國有20種，其中發(fā)現(xiàn)并命名4個(gè)雙生病毒新種，6種甘薯病毒中國新紀(jì)錄種。我國甘薯病毒特點(diǎn)為種類多、新病毒多、一株甘薯上復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重，病毒復(fù)合越多，對甘薯的產(chǎn)量影響越大（表1）。目前，甘薯常見的4種主要病毒病及其為害情況見表2。

表1 復(fù)合侵染類型及其占比情況

3 甘薯組織培養(yǎng)技術(shù)在脫毒方面的應(yīng)用

3.1 歷史概況

1960年Nielsen最先獲取甘薯脫毒苗，雖然甘薯脫毒苗培育技術(shù)起步晚，但發(fā)展迅速。莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)的興起為病毒病的控制開辟了一條新途徑。我國自1985年開展甘薯脫毒研究以來，在甘薯脫毒苗的研究上取得了顯著成果。該項(xiàng)技術(shù)在我國甘薯栽培史上產(chǎn)生了革命性的影響，成為我國繼馬鈴薯脫毒苗之后生物技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)的又一典范[9]。

表2 甘薯上發(fā)生的4種主要病毒病及其為害情況

3.2 方法研究進(jìn)展

①脫毒原理 通過對植物細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，一方面植物莖尖分生組織中沒有維管束系統(tǒng)，病毒在該區(qū)域運(yùn)動(dòng)困難；另一方面病毒的繁殖必須依賴寄主細(xì)胞的代謝過程，但無法與植物分生組織旺盛的代謝活動(dòng)相競爭。因此，分生區(qū)高濃度的生長素可能會(huì)影響病毒的繁殖[12，13]。因而，對莖尖無毒區(qū)進(jìn)行離體培養(yǎng)，理論上可得到無毒苗。

②脫毒技術(shù) 獲取無毒或少毒的甘薯莖尖一般采用層剝法，即以在無菌環(huán)境下剝?nèi)?.2～0.4 mm、并帶1～2個(gè)葉原基的莖尖為材料。近年研究發(fā)現(xiàn)，剝離到還剩5～6層時(shí)采用“一刀切”的快速剝離技術(shù)，成活率、成苗率比常規(guī)技術(shù)分別提高219.2%和429.7%[14]。

③熱脫毒技術(shù)與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合 高溫可鈍化病毒，抑制病毒生長，降低病毒移動(dòng)速度，將熱處理與莖尖培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，可利用高溫對病毒的不利影響降低莖尖分生區(qū)病毒含量，提高脫毒苗培育的成功性。梁艷榮等[15]研究證明，通過2種技術(shù)的結(jié)合可以消除常見的馬鈴薯S病毒 （PVS）和馬鈴薯X病毒（PVX），為甘薯病毒病脫毒技術(shù)的應(yīng)用提供了參考。

3.3 病毒檢測技術(shù)

甘薯莖尖分生組織培養(yǎng)得到的植株并不都是脫毒苗，只有經(jīng)過檢測，才能投入使用。迄今為止，檢測方法主要有以下4種：目測法、指示植物法、酶聯(lián)免疫吸附法、分子生物學(xué)檢測技術(shù)。

①目測法 即用人的肉眼觀察判斷。該方法主要根據(jù)甘薯葉片和塊根上表現(xiàn)出的典型癥狀判斷甘薯是否攜帶病毒。但田間的甘薯病毒往往復(fù)合侵染，有些甘薯本身具有耐毒性，因此該方法精確度不高。

②指示植物法 將疑似帶病苗與其他植物嫁接，觀察嫁接后的植株上是否產(chǎn)生枯斑，在一定范圍內(nèi)，枯斑個(gè)數(shù)與侵染性病毒的濃度成正比，因此可用枯斑數(shù)作為檢測病毒有無或多少的依據(jù)[15]。在甘薯研究中常用巴西牽牛為指示植物，經(jīng)過近幾年的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘薯、巴西牽牛試管苗嫁接法可以替代傳統(tǒng)的巴西牽牛種子苗網(wǎng)室嫁接法檢測甘薯組培苗是否帶有病毒，新方法操作簡單、靈敏度高、成本低、打破季節(jié)和環(huán)境的局限[16]。但由于組織培養(yǎng)受無菌環(huán)境的約束，該方法不能推廣到田間進(jìn)行。

③酶聯(lián)免疫法 提取樣品溶液，自然干燥后按國際馬鈴薯中心提供的酶聯(lián)包說明書進(jìn)行陽性對照。通過對比葉片、葉柄的研究結(jié)果，葉柄因含有較少雜質(zhì)、局限性小而具有較高陽性檢出率[17]。但該方法存在假陽性或假陰性的可能，在應(yīng)用上存在一定局限。

④分子生物學(xué)檢測法 分子生物學(xué)方法可分為3種，研究中最常用的為RT-PCR檢測技術(shù)，利用cRNA探針，通過雜交、擴(kuò)增目的片段的方法檢測病毒的存在。近年來，隨著檢測樣品不斷增多，每次只能檢測一種病毒，因而該技術(shù)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足學(xué)者們的研究需求，雙重RT-PCR檢測技術(shù)和多重RT-PCR檢測技術(shù)的出現(xiàn)極大地提高了病毒檢測效率[18]。相較于前幾種方法，分子生物學(xué)方法檢測靈敏度高，具有更加廣闊的應(yīng)用前景。

3.4 脫毒技術(shù)與組織培養(yǎng)技術(shù)的對比

試管苗組織培養(yǎng)技術(shù)又叫微型繁殖技術(shù)，主要利用植物離體的細(xì)胞、器官、組織等材料培育形成新植株，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源保護(hù)、果樹生產(chǎn)、珍稀植物擴(kuò)大生產(chǎn)、作物脫毒等方面，如北京華楸微型繁殖技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)苗木，補(bǔ)充市場需求[19]。莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)是最常用的脫毒技術(shù)，可以說脫毒技術(shù)是試管苗組織培育技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)重要方向，同時(shí)又是對試管苗組織培育技術(shù)的一個(gè)深入發(fā)展。從研究時(shí)長講，甘薯脫毒技術(shù)研究時(shí)間比甘薯試管苗組培技術(shù)早，直至莖尖分生組織無病或少病被發(fā)現(xiàn)，才將兩者真正有機(jī)結(jié)合在一起；從整體來看，有關(guān)試管苗組培技術(shù)的報(bào)道比脫毒技術(shù)多，技術(shù)上也相對成熟一些；從研究深度講，脫毒技術(shù)的研究進(jìn)展多停留在對MS培養(yǎng)基的改進(jìn)以及莖尖無毒組織的提取，而對與其他技術(shù)結(jié)合（如基因工程）的報(bào)道較少，研究深度不如試管苗組織培養(yǎng)技術(shù)廣。

4 甘薯脫毒技術(shù)現(xiàn)存問題及研究展望

培育甘薯脫毒苗可有效消除植物病毒，從而獲得不帶病毒植株，同時(shí)脫毒苗又具有葉面積大、葉綠素多、光合作用強(qiáng)等優(yōu)勢，可使農(nóng)作物產(chǎn)量增加，品質(zhì)得到改善。因此，對脫毒技術(shù)的深入研究是提高甘薯抗病性、質(zhì)量、產(chǎn)量的一個(gè)重要方法。

目前，隨著研究的推進(jìn)及長期觀察發(fā)現(xiàn)，甘薯脫毒技術(shù)仍存在較多未解決的問題：①病毒變異性強(qiáng)。隨著土質(zhì)、氣候的變化及人為或入侵物種的干擾，新的病毒不斷產(chǎn)生。②成功的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)條件存在差異，且不適合復(fù)制。例如脫毒甘薯一號(hào)最佳培養(yǎng)條件為1/2MS+無支持物+LED燈+30 g/L綿白糖+自來水[20]，而煙薯25最適培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L GA+0.04 mg/L IBA[14]。③脫毒苗投入生產(chǎn)不久又會(huì)重新感染病毒，脫毒持續(xù)時(shí)間較短等。

因此，今后需要建立一套完整的病毒防控系統(tǒng)，關(guān)鍵是從探究病原開始對癥下藥，一方面做好對已知病毒的控制，研究建立更具普遍性的脫毒技術(shù)；另一方面通過對現(xiàn)有病毒的分析，做好預(yù)防工作。同時(shí)，應(yīng)在深入研究脫毒技術(shù)的同時(shí)探索與其他生物技術(shù)的結(jié)合，取其精華剔除糟粕，探索真正適合甘薯生產(chǎn)的相關(guān)技術(shù)并推廣至生產(chǎn)應(yīng)用。

目前，甘薯病毒病發(fā)生嚴(yán)重，且有蔓延惡化趨勢，不但影響了甘薯產(chǎn)量，阻礙了甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展，而且不利于甘薯種質(zhì)資源的保存。因此，加強(qiáng)對甘薯病毒病脫毒技術(shù)的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用技術(shù)研究，不僅有望保護(hù)甘薯種質(zhì)資源的物種多樣性，促進(jìn)甘薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，也為今后甘薯脫毒技術(shù)的發(fā)展乃至其他生物脫毒技術(shù)的研究提供強(qiáng)大的支持，由此可見，甘薯病毒病脫毒技術(shù)的研究仍任重而道遠(yuǎn)。

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