香樟乙醇提取物對莖瘤芥黑斑病的抑制效果及活性成分分析

劉紅芳

（長江師范學院生命科學與技術(shù)學院，重慶涪陵，408100）

香樟系樟樹屬的常綠喬木植物，是我國亞熱帶常綠闊葉林的主要樹種之一，屬藥用植物，具有理氣、活血、解表、祛風除濕等功效[1，2]。關(guān)于樟樹精油的抑菌作用及其化學成分有過許多研究[3～7]，但對于樟樹葉乙醇提取物的抑菌效果及活性成分研究不多。本文研究了香樟乙醇提取物對莖瘤芥（榨菜）黑斑病的抑菌活性，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了其化學成分，初步明確了香樟乙醇提取物的抑菌活性成分，旨在為植物源抑菌農(nóng)藥新資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試的莖瘤芥（榨菜）黑斑病菌為長江師范學院生命科學與技術(shù)學院園藝植物病蟲害防治實驗室從莖瘤芥上分離、純化、鑒定后保存下來的菌株。無菌條件下將黑斑病菌接入PDA培養(yǎng)基，在25℃條件下暗培養(yǎng)7 d備用。

1.2 香樟乙醇提取物的制備

采用冷浸法提取[8]：采集香樟葉，用清水清洗干凈，在室內(nèi)自然陰干表面水分后放入鼓風干燥箱（45～50℃）烘干直至發(fā)脆，裝入1 000 mL平底磨口燒瓶內(nèi)，加入95%乙醇完全浸沒香樟葉片，蓋上玻璃磨口塞，室溫下浸泡5 d后用4層紗布過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（55℃）加壓濃縮至膏狀物，移裝于棕色磨口瓶內(nèi)，放在冰箱中（4℃）備用。

1.3 香樟提取物對莖瘤芥黑斑病的抑制作用

采用生長速率法測定香樟提取物對莖瘤芥黑斑病菌菌絲生長的抑制活性[9]：稱取 240、120、60、30 mg香樟提取物，分別加入裝有60 mL已經(jīng)融化的PDA培養(yǎng)基中，提取物在培養(yǎng)基中的濃度分別為 4.0、2.0、1.0、0.5 mg/mL，混勻后倒入直徑 9 cm 的培養(yǎng)皿中（每皿20 mL，每個處理3個重復），冷凝后分別接入直徑0.8 cm病菌的菌餅，菌絲面向下，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以不加香樟提取物的PDA培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)7 d后測定菌落直徑，根據(jù)下面公式計算抑制效果。

菌落直徑=測量直徑-8.0（菌餅直徑）；抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

根據(jù)不同濃度的抑制率，換算成幾率值，各處理的質(zhì)量體積分數(shù)（mg/mL）換成對數(shù)值，采用SPSS 17.0軟件分析，求出毒力回歸方程，算出EC50。

1.4 GC/MS分析條件

①色譜條件 弱極性DB-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm）。 進樣口溫度：280℃；升溫程序：初溫40℃，保持 3min，以3℃/min升至140℃，再以 5℃/min升至 210℃，保持 5 min；載氣（He），純度大于 99.999%，流速 1.2 mL/min；分流進樣，分流比50∶1。強極性DB-WAXetr彈性石英毛細管柱（60 m×320 μm×0.25 μm），進樣口溫度260℃；升溫程序同DB-5MS柱；分流進樣，分流比100∶1。

②質(zhì)譜條件 EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍 m/z（荷質(zhì)比）45～550，四極桿溫度 150℃，離子源溫度230℃。

1.5 成分鑒定及定量

提取物經(jīng)質(zhì)譜掃描后，在色譜工作站得到總離子流量圖，檢索NISTDEMO標準譜庫，進行譜圖解析，確定各色譜峰對應的化學成分，采用化學計量學方法對重疊峰進行分辨，用峰面積歸一法對各化合物進行定量，計算出各組分的相對含量[10，11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟提取物對莖瘤芥黑斑病病菌的抑制作用

從表1可以看出，不同濃度的香樟提取物對病菌的抑制作用不同，設(shè)置的 4.0、2.0、1.0、0.5 mg/mL 4個濃度對莖瘤芥黑斑病菌生長的抑制率分別是 63%、58%、53%、49%。抑制作用隨著設(shè)置濃度的減小逐漸下降，0.5 mg/mL時，抑制率不足50%。香樟乙醇提取物4個濃度對莖瘤芥黑斑病菌的抑制作用均與對照差異極顯著。

將不同濃度的抑制率換算成幾率值，各處理的質(zhì)量體積分數(shù)（mg/mL）換成對數(shù)值，用SPSS 17.0軟件分析，得出毒力回歸方程為=4.840 7-0.304 6 x，EC50為0.299 9，95%置信區(qū)間 （%） 為 0.252 6～0.356 1，相關(guān)系數(shù)（）為-0.997 5。

表1 香樟提取物對莖瘤芥黑斑病菌的抑制作用

表2 香樟乙醇提取物抑菌活性成分分析

2.2 香樟乙醇提取物對莖瘤芥黑斑病的抑制活性成分分析

圖1為香樟乙醇提取物的氣相色譜，相關(guān)化合物的鑒定如表2所示。譜峰出峰時間大都集中在11～19 min。香樟的乙醇提取物中共鑒定出21個化合物，包括烯烴、炔烴、醛、酮、醇、醚、酯等多種成分。其成分主要為酯類化合物，包括飽和脂肪酸酯與不飽和脂肪酸酯：14-甲基十五酸甲酯 （0.41%）、棕櫚酸乙酯（13.61%）、十七烷酸乙酯（1.07%）、丁二酸二甲酯 （0.79%）、十七碳烯酸甲酯 （0.20%）、9，12，15-十八碳三烯酸甲酯（42.92%）。另外，石竹烯氧化物（3.90%）、1-環(huán)己基丙炔 （7.38%）、2-（1-咪唑基）乙酸（7.25%）、4-甲氧基苯甲醇（3.77%）、葉綠醇（8.46%）等化合物也較豐富?？梢姡阏恋囊掖继崛∥锏闹饕煞质呛趸衔?，共16個，占提取物總量的79.46%，其中，醛類化合物1個，含量為0.43%；醇類化合物為6個，含量為15.56%；環(huán)醚1個，含量為3.90%；飽和脂肪酸酯類4個，含量為15.88%；不飽和脂肪酸酯類化合物2個，含量為43.12%。含氧且含氮化合物2個，含量為10.48%。另外，烯烴、炔烴各1個，含量分別為1.72%、7.38%。由以上分析可總結(jié)出，香樟的乙醇提取液中酯類物質(zhì)居多，且以9，12，15-十八碳三烯酸甲酯、棕櫚酸乙酯為主要成分。

圖1 香樟乙醇浸提物的GC-MS總離子流

3 小結(jié)與討論

本試驗采用生長速率法測定了香樟提取物對莖瘤芥黑斑病菌菌絲生長的抑制活性，發(fā)現(xiàn)設(shè)置的4個濃度對病菌的生長均有一定的抑制作用，但隨著濃度的減小，抑制作用逐漸下降，0.5 mg/mL時，抑制率不足50%。方差分析結(jié)果顯示，不同濃度處理的莖瘤芥黑斑病病菌直徑均明顯低于對照。通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）檢測香樟葉的乙醇浸提物的化學成分，共檢測出21種化合物，包括烯烴、炔烴、醛、酮、醇、醚、酯等多種成分。其成分主要為酯類化合物，包括飽和脂肪酸酯與不飽和脂肪酸酯，占提取物總量的79.46%。

我國樟樹資源非常豐富，其乙醇提取物的抑菌活性的研究為提高樟樹綜合經(jīng)濟效益提供了依據(jù)。為了加深樟樹作為植物源殺菌劑的開發(fā)和利用，應進一步研究其對莖瘤芥黑斑病菌抑菌活性的作用方式和作用機理等，并深入研究其對其他植物病原真菌的生物活性。

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