凍融囊胚移植結(jié)局的影響因素分析

邱乒乒，王燁，紀(jì)紅，沙艷偉，何雪梅，李萍

(廈門市婦幼保健院，廈門 361003)

在輔助生殖領(lǐng)域，囊胚移植與卵裂胚相比顯示出更為明顯的優(yōu)勢(shì)：①有利于挑選發(fā)育潛能更大的胚胎；②具有更高的種植率；③有效降低移植胚胎數(shù)；④胚胎與子宮內(nèi)膜的同步性更佳[1]。近年來隨著囊胚培養(yǎng)液體系的逐步改善及囊胚凍融技術(shù)的日益成熟，囊胚培養(yǎng)與移植在輔助生殖領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。較多研究證實(shí)復(fù)蘇周期囊胚移植的臨床妊娠率、種植率均顯著優(yōu)于新鮮周期[2-3]。由于凍融D3胚胎后行囊胚培養(yǎng)可能導(dǎo)致取消移植周期的增多，加重患者的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，加之目前囊胚凍融后的復(fù)蘇存活率已與卵裂期胚胎無異，因此大部分生殖中心多在新鮮周期行囊胚培養(yǎng)，將可用囊胚進(jìn)行冷凍后再行凍融囊胚移植。本研究回顧性分析我院2016年1～12月復(fù)蘇周期中380例囊胚移植的臨床數(shù)據(jù)資料，比較囊胚發(fā)育天數(shù)、囊胚質(zhì)量、移植囊胚數(shù)等因素對(duì)臨床妊娠結(jié)局的影響，以優(yōu)化復(fù)蘇周期的囊胚移植策略，為復(fù)蘇周期行選擇性單囊胚移植提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2016年1～12月在廈門市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科行凍融囊胚移植的患者資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：新鮮周期不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩?、子宮內(nèi)膜異位癥(EM)及子宮腺肌癥(AM)、男方因素。

排除標(biāo)準(zhǔn)：在一個(gè)復(fù)蘇周期中同時(shí)移植D5和D6囊胚的患者以及移植D7囊胚的患者。

按照以上標(biāo)準(zhǔn)共納入 357 例患者，共380個(gè)凍融囊胚移植周期。根據(jù)妊娠結(jié)局將患者分為2組：臨床妊娠組(259周期)；未臨床妊娠組(121周期)。

二、方法

1.囊胚培養(yǎng)及評(píng)分：本研究納入的357例患者在新鮮周期中所采用的促排卵方案按照本中心的常規(guī)進(jìn)行，獲卵后行IVF或ICSI授精。胚胎培養(yǎng)采用Vitrolife(瑞典)序貫培養(yǎng)液。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、6% CO2、5% O2和89% N2。受精后第3日挑選2個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植或冷凍，剩余胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。D5和D6分別觀察囊胚形成情況。

囊胚評(píng)分參考Gardner評(píng)分系統(tǒng)[4]。根據(jù)囊腔的擴(kuò)張程度對(duì)囊胚進(jìn)行分期，共分為1～6期。對(duì)3～6期的囊胚行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。

內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)評(píng)分：A，細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密，碎片少；B，細(xì)胞數(shù)目較少，結(jié)合較松散；C，細(xì)胞數(shù)目極少，難以辨認(rèn)。

外滋養(yǎng)層(TE)評(píng)分：A，細(xì)胞數(shù)量>10，大小均勻；B，細(xì)胞數(shù)量≈10，大小不均；C，細(xì)胞數(shù)量<10，大小不均，存在碎片。

本實(shí)驗(yàn)室將ICM與TE的評(píng)分為AA、BA、AB、BB的囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。

考慮到早期囊胚的復(fù)蘇率不佳，本實(shí)驗(yàn)室將發(fā)育到3期以上的囊胚進(jìn)行冷凍保存。冷凍囊胚標(biāo)準(zhǔn)為：3期以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)級(jí)在B級(jí)以上的囊胚。

2.囊胚冷凍及復(fù)蘇：本實(shí)驗(yàn)室采用玻璃化冷凍方法進(jìn)行囊胚冷凍。囊胚冷凍之前使用激光打孔的方法進(jìn)行人工皺縮，其后的冷凍及復(fù)蘇操作均按照Origio(丹麥)玻璃化冷凍、解凍試劑盒說明書進(jìn)行。解凍后的囊胚培養(yǎng)3～8 h后進(jìn)行移植，解凍后2 h依據(jù)囊胚腔是否重新擴(kuò)張來判斷囊胚是否存活。

3. 子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備與囊胚移植：⑴人工周期：D2～D3開始口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜耳，德國(guó))4 mg/d，每隔5～7 d監(jiān)測(cè)一次內(nèi)膜，每次以2 mg遞增，當(dāng)內(nèi)膜≥7 mm(服用補(bǔ)佳樂至少14 d后)口服黃體酮(安琪坦，博賞，法國(guó))(300 mg，2次/d)，黃體酮轉(zhuǎn)化6 d后凍胚移植。⑵降調(diào)人工周期：D1～D2采用B超檢查子宮、卵巢、AFC數(shù)目及大小等盆腔情況，注射長(zhǎng)效GnRH-a 3.75 mg，28～35 d后開始口服補(bǔ)佳樂(2 mg，2次/d)，每隔5～7 d監(jiān)測(cè)一次內(nèi)膜，每次以2 mg遞增，當(dāng)內(nèi)膜≥7 mm(服用補(bǔ)佳樂至少14 d后)口服黃體酮(300 mg，2次/d)，黃體酮轉(zhuǎn)化6 d后凍胚移植。

移植后使用黃體酮凝膠(雪諾同，默克雪蘭諾，瑞士)90 mg/d陰道給藥行黃體支持，至移植后10 d測(cè)血β-HCG。

4.移植后結(jié)局判定：胚胎移植后4～6周，B超探及妊娠囊，確診為臨床妊娠；B超未探及妊娠囊判定為未臨床妊娠。擬診異位妊娠或?qū)m內(nèi)合并宮外妊娠者，積極觀察，一經(jīng)確診盡早留院處理。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植囊胚周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者基礎(chǔ)情況比較

2016年1～12月本院進(jìn)行囊胚復(fù)蘇的共380個(gè)周期。根據(jù)妊娠結(jié)局將患者分臨床妊娠組和未臨床妊娠組，兩組患者的年齡、BMI、AMH、內(nèi)膜厚度、不孕原因構(gòu)成比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與妊娠組比較，未妊娠組患者不孕年限顯著增長(zhǎng)(P<0.05)(表1)。

二、兩組患者的臨床治療及移植情況

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩組患者的治療方式無顯著性差異(P>0.05)；與妊娠組比較，未妊娠組患者平均移植胚胎數(shù)顯著減少(P<0.01)；妊娠組中D5囊胚所占的比例顯著高于未妊娠組(P<0.01)；妊娠組中雙優(yōu)胚所占的比例顯著升高(P<0.01)，非優(yōu)胚所占的比例顯著降低(P<0.01)；妊娠組中優(yōu)質(zhì)囊胚(雙優(yōu)囊胚數(shù)與單優(yōu)囊胚數(shù)之和)所占的比例顯著高于未妊娠組(P<0.01)(表2)。

三、Logistic回歸分析

從上述未經(jīng)其他因素校正的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)得出，囊胚質(zhì)量和囊胚發(fā)育速度與臨床妊娠率有關(guān)，因此在單因素分析中可將囊胚質(zhì)量及囊胚發(fā)育天數(shù)作為預(yù)測(cè)臨床妊娠的兩個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。為了進(jìn)一步綜合分析各因素對(duì)妊娠結(jié)局的影響，將是否臨床妊娠作為因變量，女方年齡、不孕年限、囊胚發(fā)育天數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析。

分析結(jié)果顯示，≥39歲患者的妊娠率顯著低于<35歲組[OR0.339，95%CI(0.130，0.886)；P=0.027)；雙優(yōu)胚和單優(yōu)胚移植組間的妊娠率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[OR0.579，95%CI(0.290，1.156)；P=0.121)，而非優(yōu)胚移植組的妊娠率相較雙優(yōu)胚移植組顯著下降[OR0.362，95%CI(0.174，0.753；P=0.007)；在校正了以上各因素后，D5和D6囊胚的臨床妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

討 論

隨著囊胚玻璃化冷凍技術(shù)的日趨成熟，與新鮮周期相比，復(fù)蘇周期囊胚移植更具優(yōu)勢(shì)?？赡茉蚴悄遗邇鋈诒旧硪矘?gòu)成對(duì)囊胚的一種篩選，發(fā)育潛能較低或質(zhì)量較差的囊胚在凍融之后不能實(shí)現(xiàn)再次擴(kuò)張[5-6]，而在進(jìn)行復(fù)蘇周期移植時(shí)棄用了這部分囊胚。在新鮮周期中D5形成囊胚的種植率和妊娠率明顯高于D6形成的囊胚，其原因可能是受到了內(nèi)膜容受性的影響[7-10]。而復(fù)蘇周期中的內(nèi)膜因素得以更好的控制，更能客觀地對(duì)各影響因素進(jìn)行分析，因此本文選取復(fù)蘇周期中的囊胚移植為研究對(duì)象，通過單因素分析及多元Logistic回歸比較了囊胚發(fā)育天數(shù)、囊胚質(zhì)量、移植胚胎數(shù)等因素對(duì)妊娠結(jié)局不同的影響。

表1 兩組患者基本資料[(-±s)，n(%)]

注：與妊娠組相比，*P<0.05

表2 兩組患者的移植情況[(-±s)，n(%)]

注：與未妊娠組比較，*P<0.01

表3 Logistic回歸Enter法

目前關(guān)于囊胚發(fā)育天數(shù)是否會(huì)對(duì)妊娠率和種植率產(chǎn)生影響，文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果并不一致。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)現(xiàn)D5和D6囊胚的整倍體率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[11]。一項(xiàng)納入15篇復(fù)蘇周期囊胚移植文章的Meta分析，統(tǒng)計(jì)了2 502個(gè)凍融囊胚移植周期，發(fā)現(xiàn)D5組囊胚移植后的臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率和活產(chǎn)率明顯高于D6組，但是精確比較D5和D6發(fā)育到同一階段的囊胚移植結(jié)局時(shí)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[12]。在本研究中，進(jìn)行囊胚發(fā)育天數(shù)的單因素分析時(shí)，D5囊胚的臨床妊娠率顯著高于D6囊胚。然而隨后進(jìn)行的多元Logistic回歸分析顯示囊胚發(fā)育天數(shù)的差異對(duì)妊娠結(jié)局無顯著的影響，臨床妊娠率與移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)的相關(guān)性最大。D5的平均移植囊胚數(shù)為(1.75±0.43)枚，D6的平均移植囊胚數(shù)為(1.66±0.48)枚(P=0.11)，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此本研究數(shù)據(jù)表明，囊胚質(zhì)量對(duì)妊娠結(jié)局的影響大于囊胚發(fā)育速度。Yang等[13]也報(bào)道了相似的結(jié)果，其將1 374個(gè)D5囊胚復(fù)蘇周期和255個(gè)D6囊胚復(fù)蘇周期進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)D5優(yōu)質(zhì)囊胚和D6優(yōu)質(zhì)囊胚的臨床妊娠率、種植率無顯著差異(分別為52.4% vs. 52.6%；38.9% vs. 35.6%)。故我們建議在進(jìn)行復(fù)蘇周期囊胚移植時(shí)，應(yīng)首先選擇評(píng)級(jí)高的囊胚；而在囊胚評(píng)級(jí)相同的情況下，優(yōu)選D5形成的囊胚進(jìn)行移植。

近期文獻(xiàn)報(bào)道，在新鮮周期中，囊胚的擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)級(jí)和外滋養(yǎng)層評(píng)級(jí)與臨床妊娠率及活產(chǎn)率有密切聯(lián)系[14]。Kresowik等[15]的研究表明與非擴(kuò)張期的囊胚相比移植擴(kuò)張期的囊胚會(huì)得到更高的種植率。本研究選擇3期以上的囊胚進(jìn)行冷凍，在期別上有較好的同質(zhì)性，規(guī)避了囊胚不同期別對(duì)臨床結(jié)局的影響。另有一些研究表明無論在新鮮周期還是在復(fù)蘇周期中TE的評(píng)級(jí)對(duì)臨床結(jié)局最具預(yù)測(cè)價(jià)值[16-18]，移植ICM評(píng)級(jí)為A的囊胚能夠降低早期流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[14]。與大多數(shù)文獻(xiàn)相同，我們對(duì)于囊胚的評(píng)分也采用了Gardner評(píng)分系統(tǒng)，但此系統(tǒng)對(duì)于ICM和TE形態(tài)學(xué)的描述較寬泛，因此不同的胚胎學(xué)家對(duì)囊胚評(píng)級(jí)帶有較大的主觀性。本研究中我們對(duì)于ICM和TE的評(píng)級(jí)采用了更具體的量化標(biāo)準(zhǔn)，減少了本實(shí)驗(yàn)室不同的評(píng)分者之間的主觀差異。在此前提下，我們分析數(shù)據(jù)得出移植優(yōu)質(zhì)囊胚組的臨床妊娠率顯著高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組，即ICM和TE評(píng)級(jí)高的囊胚其妊娠率也較高，這一結(jié)論與前人的報(bào)道一致。同時(shí)我們也關(guān)注到，有文獻(xiàn)研究表明囊胚的擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)級(jí)和外滋養(yǎng)層評(píng)級(jí)三者之間可能存在內(nèi)在的聯(lián)系。擴(kuò)張程度高的囊胚其TE細(xì)胞數(shù)也較多，連接緊密，功能也比較好[16]。而ICM和TE之間也有關(guān)聯(lián)，囊胚評(píng)級(jí)為AA、BB、CC的概率高于其他組合[14]。因此更好地了解三種形態(tài)學(xué)參數(shù)之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)有利于在選擇最優(yōu)囊胚移植上達(dá)成共識(shí)。

眾多研究表明，多胎妊娠顯著增加妊娠期糖尿病、高血壓、剖宮產(chǎn)等產(chǎn)婦風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也增加新生兒的早產(chǎn)率、低體質(zhì)量?jī)郝始八捞ヂ蔥19]。因此為了保障單胎活產(chǎn)率，國(guó)內(nèi)外領(lǐng)先的生殖中心已開始實(shí)施選擇性單囊胚移植。本研究的數(shù)據(jù)顯示復(fù)蘇周期中單優(yōu)胚移植組的臨床妊娠率與雙優(yōu)胚組之間無顯著性差異，因此對(duì)于<35歲，且有優(yōu)質(zhì)囊胚的患者應(yīng)優(yōu)先選擇單囊胚移植。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Practice Committees of the American Society for Reproductive Medicine and the Society for Assisted Reproductive Technology. Blastocyst culture and transfer in clinical-assisted reproduction： a committee opinion[J]. Fertil Steril，2013，99： 667-672.

[2] Zhu D，Zhang J，Cao S，et al. Vitrified-warmed blastocyst transfer cycles yield higher pregnancy and implantation rates compared with fresh blastocyst transfer cycles—time for a new embryo transfer strategy?[J]. Fertil Steril，2011，95： 1691-1695.

[3] 何巧花，李杭生，張國(guó)玲，等. 新鮮囊胚與玻璃化冷凍囊胚復(fù)融周期移植的臨床結(jié)局比較[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2014，23： 809-812.

[4] Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al. Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome： towards a single blastocyst transfer[J]. Fertil Steril，2000，73： 1155-1158.

[5] Yin H，Hong J，He R，et al. The effects of blastocyst morphological score and blastocoele re-expansion speed after warming on pregnancy outcomes[J].Clin Exp Reprod Med，2016，43： 31-37.

[6] Shu Y，Watt J，Gebhardt J，et al. The value of fast blastocoele re-expansion in the selection of a viable thawed blastocyst for transfer[J]. Fertil Steril，2009，91： 401-406.

[7] Shapiro BS，Daneshmand ST，Garner FC，et al. Contrasting patterns in in vitro fertilization pregnancy rates among fresh autologous，fresh oocyte donor，and cryopreserved cycles with the use of day 5 or day 6 blastocysts may reflect differences in embryo-endometrium synchrony[J]. Fertil Steril，2008，89： 20-26.

[8] 宋文妍，侯小漫，吳亮，等. 體外受精-胚胎移植周期中不同天數(shù)和發(fā)育階段囊胚移植妊娠結(jié)局的比較[J]. 生殖與避孕，2016，36： 807-815.

[9] Wang X，Zhen J，Sun Z，et al. Effects of fifth day(D5) or sixth day(D6) frozen-thawed blastocysts on neonatal outcomes[J].Zygote，2016，24： 684-691.

[10] Elgindy E，Elsedeek S E. Day 5 expanded blastocysts transferred on same day have comparable outcome to those left for more extended culture and transferred on day 6[J].J Assist Reprod Genet，2012，29： 1111-1115.

[11] Capalbo A，Rienzi L，Cimadomo D，et al. Correlation between standard blastocyst morphology，euploidy and implantation： an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts[J].Hum Reprod，2014，29： 1173-1181.

[12] Sunkara SK，Siozos Abolton VN，Khalaf Y，et al. The influence of delayed blastocyst formation on the outcome of frozen-thawed blastocyst transfer： a systematic review and meta-analysis[J].Hum Reprod，2010，25： 1906-1915.

[13] Yang H，Yang Q，Dai S，et al. Comparison of differences in development potentials between frozen-thawed D5 and D6 blastocysts and their relationship with pregnancy outcomes[J].J Assist Reprod Genet，2016，33： 865-872.

[14] Van DE，Balaban B，Ziebe S，et al. Association between blastocyst morphology and outcome of single-blastocyst transfer[J/OL].Reprod Biomed Online，2013，27： 353-361.

[15] Kresowik JDK，Sparks AET，Van Voorhis BJ. Clinical factors associated with live birth after single embryo transfer[J]. Fertil Steril，2012，98： 1152-1156.

[16] Ahlstr?m A，Westin C，Reismer E，et al. Trophectoderm morphology： an important parameter for predicting live birth after single blastocyst transfer[J].Hum Reprod，2011，26： 3289-3296.

[17] Hill MJ，Richter KS，Heitmann RJ，et al. Trophectoderm grade predicts outcomes of single-blastocyst transfers[J]. Fertil Steril，2013，99： 1283-1289.

[18] Honnma H，Baba T，Sasaki M，et al. Trophectoderm morphology significantly affects the rates of ongoing pregnancy and miscarriage in frozen-thawed single-blastocyst transfer cycle in vitro fertilization[J]. Fertil Steril，2012，98： 361-367.

[19] 來天嬌，郭藝紅. 多胎妊娠減胎術(shù)倫理爭(zhēng)議[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2017，26： 219-223.