利用鼠胚實(shí)驗(yàn)對(duì)新建人類輔助生殖實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制分析

屈春鳳，莫鳳明，蔣軍松，韋福慶，韋海燕

(廣西河池市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河池 547000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)是一項(xiàng)有效治療不孕不育的人類輔助生殖技術(shù)(ART)，而IVF實(shí)驗(yàn)室好比一座加工廠，對(duì)IVF結(jié)局有著極為重要的影響[1]。相對(duì)于體內(nèi)，體外培養(yǎng)的配子/胚胎脫離了母體自身保護(hù)，不具備任何保護(hù)屏障，對(duì)體外微環(huán)境的變化非常敏感，有可能會(huì)影響其發(fā)育潛能。因此，在輔助生殖全過程中需要有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制系統(tǒng)與質(zhì)量保障系統(tǒng)為配子和胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的場(chǎng)所。那么，對(duì)于新建IVF實(shí)驗(yàn)室在啟用前，更應(yīng)該全方位地監(jiān)督和檢測(cè)各個(gè)環(huán)節(jié)，以建立穩(wěn)定、可靠的培養(yǎng)體系，保證胚胎的質(zhì)量。鼠胚實(shí)驗(yàn)(mouse embryo assay，MEA)是目前最常用于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)液、耗材及設(shè)備質(zhì)量控制的生物檢測(cè)方法，適用于新建或新啟動(dòng)周期的IVF實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制[2]。我院IVF胚胎實(shí)驗(yàn)室于2016年初建成，啟用前對(duì)其進(jìn)行了為期1個(gè)月的“熱處理”[3]后，自6月至11月，在新實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，我們利用昆明系小白鼠行體內(nèi)外受精及胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)控評(píng)估，為開展人類胚胎體外培養(yǎng)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及質(zhì)量保障。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)情況報(bào)道如下。

一、材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡雌性昆明系小白鼠、8周齡以上雄性昆明系小白鼠，均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在控光(白天光照12 h，夜間黑暗12 h)、控溫(20～25℃)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后方用于實(shí)驗(yàn)。

2. 試劑與設(shè)備：取胚胎處理液G-MOPS、洗精受精液G-IVF、卵裂胚培養(yǎng)液G1、囊胚培養(yǎng)液G2、人血清白蛋白HAS、石蠟油，均為瑞典Vitrolife 公司產(chǎn)品；Labotect CO2培養(yǎng)箱(德國(guó))；K-SYSTEMS三氣培養(yǎng)箱(丹麥)；NIKON 解剖顯微鏡、NIKON 倒置顯微鏡(日本)；K-SYSTEMS IVF工作站(丹麥)；Labotect CO2濃度檢測(cè)儀(德國(guó))等。

3. 小鼠超排卵[4]：將注射用血促性素(PMSG)和注射用絨促性素(HCG，均購(gòu)自杭州動(dòng)物藥品廠)配制成100 U/ml的溶液，分裝保存于-20℃。培養(yǎng)液均于使用前一天下午配制好后置于37℃、含6%CO2濃度培養(yǎng)箱過夜平衡，G-MOPS置于37℃恒溫箱平衡。雌鼠腹腔內(nèi)注射PMSG 10 U/只，48 h后再腹腔內(nèi)注射HCG 10 U/只。

4. 體外受精實(shí)驗(yàn)：(1)卵母細(xì)胞的采集：HCG后15～16 h采用頸椎脫臼法處死雌鼠，無菌條件下取出輸卵管，于G-MOPS+10%HAS中沖洗3次，用1 ml注射器于體視鏡下輕輕刺破輸卵管膨大部使卵子團(tuán)釋放出來，將其收集并轉(zhuǎn)移至G-IVF受精液中，于37℃、含6%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待授精。(2)精子的采集與獲能：采用頸椎脫臼法處死雄鼠，無菌條件下取出附睪尾，于G-MOPS+10%HAS中沖洗3次，用眼科鑷輕輕擠出精子，收集精子懸液加入裝有G-IVF液的試管底部，置于37℃、含6%CO2濃度培養(yǎng)箱中上游并獲能30～60 min。(3)體外受精與培養(yǎng)：收集獲能后上層精子于另一試管中，顯微鏡下觀察其活力及濃度，取適量精子懸液加入含有卵子團(tuán)的G-IVF液中，使其終濃度約為1.5×106/ml，置于37℃、含6%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，授精4 h后將卵子移至另一含G-IVF液受精皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

5. 體內(nèi)受精實(shí)驗(yàn)：HCG后將雌雄小鼠按1∶1合籠，次日早上觀察雌鼠是否見陰栓。觀察到陰栓的雌鼠以頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出輸卵管，于G-MOPS+10%HAS中沖洗3次，用1 ml注射器于體視鏡下輕輕刺破輸卵管膨大部使合子釋放出，將其收集并轉(zhuǎn)移至G-IVF受精液中，于37℃、含6%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6. 原核及卵裂期胚胎的觀察與培養(yǎng)(圖1)：D0：下午原核觀察；D1：上午2細(xì)胞期胚胎觀察，并將其轉(zhuǎn)至已過夜平衡的卵裂胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)；D2：上午4細(xì)胞期胚胎觀察，下午8細(xì)胞期胚胎觀察，并轉(zhuǎn)至已過夜平衡的囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)；D3：上午桑椹期胚胎觀察；D4：上午早期囊胚觀察；D5～D6：上午囊胚觀察。

7. 數(shù)據(jù)分析：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1. 體外受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果：共進(jìn)行了25個(gè)體外受精周期實(shí)驗(yàn)，總獲卵1 023個(gè)，其中原核受精胚共823個(gè)，受精率為80.4%，卵裂率為95.1%，2-細(xì)胞囊胚形成率為77.1%(表1)。

表1 昆明系小白鼠體外受精及胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A：合子；B：2-細(xì)胞胚胎；C：4-細(xì)胞胚胎；D：8-細(xì)胞胚胎；E：桑葚胚；F：囊胚圖1 不同發(fā)育階段的小鼠胚胎(×10)

2.體內(nèi)受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果：共進(jìn)行了17個(gè)體內(nèi)受精周期實(shí)驗(yàn)，共獲卵642個(gè)，其中原核受精胚513個(gè)，受精率79.9%，卵裂率為97.1%，2-細(xì)胞囊胚形成率為80.9%(表2)。

3.兩組實(shí)驗(yàn)小鼠胚胎體外培養(yǎng)結(jié)果比較：體內(nèi)受精組與體外受精組相比，其受精率、卵裂率及2-細(xì)胞囊胚形成率兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表2 昆明系小白鼠體內(nèi)受精及胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 兩組實(shí)驗(yàn)小鼠胚胎體外培養(yǎng)結(jié)果比較(%)

三、討論

輔助生殖技術(shù)與其他學(xué)科最大的區(qū)別在于其對(duì)胚胎實(shí)驗(yàn)室的依賴性和協(xié)同性。因此，胚胎實(shí)驗(yàn)室是ART實(shí)施的重要支撐點(diǎn)，是保證ART成功的重要核心條件。實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制系統(tǒng)不僅能確保結(jié)果的穩(wěn)定性，而且還可追蹤實(shí)驗(yàn)室操作事件[5]。胚胎體外受精與培養(yǎng)是一種人工模擬輸卵管、子宮環(huán)境的過程，所有直接或間接接觸配子和胚胎的用品及環(huán)境，如溫度、濕度、CO2濃度、pH、滲透壓、離子濃度、塵埃、揮發(fā)性有機(jī)物(VOC)等均有可能存在危害胚胎的因素[6-7]。目前，MEA是評(píng)估IVF實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)體系最為廣泛應(yīng)用的方法，不僅能夠反映胚胎的發(fā)育潛能，同時(shí)還能監(jiān)測(cè)胚胎實(shí)驗(yàn)室整體的培養(yǎng)環(huán)境條件及操作技能，如空氣質(zhì)量、溫濕度、培養(yǎng)液、耗材、培養(yǎng)箱、氣體以及技術(shù)人員操作水平等[8-9]。

本研究利用昆明系小白鼠行體內(nèi)、體外受精兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)本中心新建的輔助生殖實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)系統(tǒng)及技術(shù)員操作水平進(jìn)行了全面的質(zhì)量控制。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是小鼠體內(nèi)或體外獲得的原核受精胚，皆能在體外培養(yǎng)發(fā)育至囊胚階段，胚胎發(fā)育狀況良好，且受精率(79.9% vs. 80.4%)、卵裂率(97.1% vs. 95.1%)、2-細(xì)胞囊胚形成率(80.9% vs. 77.1%)相比較，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其囊胚率比國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]的偏低，但各項(xiàng)指標(biāo)均符合人類輔助生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[2，12-13]。以上結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)體系以及技術(shù)人員的操作水平已合格，能夠繼續(xù)開展人類IVF技術(shù)項(xiàng)目。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，會(huì)有多種因素影響到胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。從表1、表2可見，前兩個(gè)批次周期的受精率和囊胚形成率低，波動(dòng)較大。分析其原因可能是：(1)實(shí)驗(yàn)初期，技術(shù)人員操作技術(shù)不夠熟練，體外操作時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)液溫度、滲透壓等改變，進(jìn)而影響了后續(xù)胚胎發(fā)育；(2)熱臺(tái)溫度設(shè)置時(shí)欠考慮培養(yǎng)皿熱傳導(dǎo)和熱丟失，造成溫度波動(dòng)，可能導(dǎo)致了胚胎不可逆的損傷。溫度對(duì)卵子的影響是顯而易見的，溫度的變化會(huì)影響卵子內(nèi)部一些結(jié)構(gòu)的變化，其主要影響紡錘體的形態(tài)。有學(xué)者通過對(duì)加溫裝置的改進(jìn)發(fā)現(xiàn)，若微滴內(nèi)溫度保持在37℃，在更多的卵子內(nèi)會(huì)觀察到紡錘體的存在，并且可顯著提高受精率和懷孕率；(3) 觀察的時(shí)間和次數(shù)增加，導(dǎo)致卵子和胚胎體外曝光的時(shí)間延長(zhǎng)。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，輔助生殖中光照影響早期胚胎發(fā)育[14]。針對(duì)發(fā)現(xiàn)的問題，我們及時(shí)地進(jìn)行了糾正，隨著操作技術(shù)的不斷嫻熟，后續(xù)實(shí)驗(yàn)的受精率、卵裂率及囊胚形成率也在提高。但在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，同批次小鼠，同樣的培養(yǎng)環(huán)境，同樣批號(hào)的試劑、促排藥物等，同樣的操作技術(shù)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)，考慮到胚胎體外受精及培養(yǎng)受諸多因素的影響，其可能與精子及卵子的質(zhì)量有關(guān)，或者與雌鼠的發(fā)情周期有關(guān)[15]，隨著周齡增長(zhǎng)雌雄小鼠的配子質(zhì)量亦會(huì)下降，尤其是雌鼠對(duì)促排的效果明顯降低，因此在實(shí)驗(yàn)中，我們盡量使用適齡的雌雄小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以期達(dá)到理想的效果。

通過鼠胚實(shí)驗(yàn)，我們技術(shù)人員的操作水平及熟練程度得到了很大的鍛煉和提高，但在保證實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度以及操作章程符合要求的情況下，一些細(xì)微之處也不容忽視。在實(shí)驗(yàn)中我們注意到，培養(yǎng)箱的打開時(shí)間和次數(shù)也會(huì)影響到囊胚形成率，這與相關(guān)研究[16]一致。因此，在今后工作中，需謹(jǐn)慎對(duì)待每一項(xiàng)操作規(guī)程，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，提升技術(shù)，保證人類IVF技術(shù)實(shí)施的可靠性與穩(wěn)定性。

總之，對(duì)于新建或新啟動(dòng)周期的IVF實(shí)驗(yàn)室，為了保證培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)系統(tǒng)的可靠性，利用鼠胚實(shí)驗(yàn)對(duì)影響配子受精及胚胎發(fā)育的因素進(jìn)行質(zhì)量控制是有必要的。

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