七葉蓮總皂苷體內外降尿酸作用及對高尿酸血癥小鼠尿酸轉運蛋白的影響

朱玲玲，陳寶軍

臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）臺州醫(yī)院，浙江 臺州 317000

高尿酸血癥是由尿酸的產生和排泄功能障礙而引起其水平升高為特征的一種疾病。尿酸是嘌呤化合物的代謝終產物，在黃嘌呤氧化酶作用下，次黃嘌呤氧化成黃嘌呤，黃嘌呤氧化成尿酸[1]。痛風是一種與體內高尿酸水平相關的代謝紊亂疾病，可以引起炎癥、痛風性關節(jié)炎和尿酸性腎結石。目前針對痛風的治療方法主要是治療炎癥和控制高尿酸血癥，黃嘌呤氧化酶被認為是高尿酸血癥最重要的治療靶點[2]。別嘌呤醇是一種肝臟黃嘌呤氧化酶抑制劑，主要用于治療高尿酸血癥和痛風。然而，它的臨床用途經常受到副作用的限制，例如發(fā)熱、皮膚皮疹、過敏反應、肝炎、史蒂文斯-約翰遜綜合征等，甚至發(fā)生致死性肝壞死和腎病。因此，急需開發(fā)一種對高尿酸血癥和痛風治療有效的替代療法[3]。

七葉蓮[Schefflera venulosa(Wight et Arn.)Harms]為五加科鵝掌柴屬植物，又名漢桃葉、七加皮、七葉爛、手樹等，廣泛分布于我國華南地區(qū)，主產于我國廣東、廣西、福建、臺灣、云南和貴州等地。性溫，味微苦，主要含有萜烯類、三萜皂苷類和有機酸類等化學成分，具有祛風除濕、催眠和活血止痛等功效，對三叉神經痛、坐骨神經痛、神經性頭痛、風濕性關節(jié)痛以及跌打腫痛等均有一定的緩解作用[4～7]。近年來，對于七葉蓮的化學成分和藥理活性的研究逐漸增多，具有較好的開發(fā)前景，引起了許多學者的關注[8～9]。本研究的目的是通過體外相關酶系統(tǒng)和體內高尿酸血癥小鼠模型來確定七葉蓮總皂苷對黃嘌呤氧化酶的抑制活性和抗高尿酸血癥作用，并探討其對尿酸轉運蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 七葉蓮藥材采自云南省文山壯族苗族自治州文山縣，七葉蓮總皂苷由本實驗室自制；氧嗪酸鉀，乙胺丁醇，別嘌呤醇(湖北信康醫(yī)藥化工有限公司)；黃嘌呤(上海恒遠生物科技有限公司)；血清尿酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Lowry蛋白濃度測定試劑盒(美國Solarbio公司)；Anti-URAT1(美國 Abcam 公司)；TRE-Trizol(美國Invitrogen公司)。其余試劑均為分析純；水為純凈水。

雄性ICR小鼠60只，4周齡，體質量(22±2)g，購自浙江大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK(浙)2014-0012。在溫度為(23±2)℃、濕度為(50±10)%、12 h光照交替的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 體外黃嘌呤氧化酶活性測定 通過檢測在反應系統(tǒng)中尿酸的生成量來衡量七葉蓮總皂苷對黃嘌呤氧化酶的抑制活性。該反應系統(tǒng)包括0.6mL的100mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，0.1 mL樣品，0.1 mL黃嘌呤氧化酶(0.2 U/mL)和0.2 mL的1 mmol/L黃嘌呤(溶于0.1 mol/L NaOH溶液中)。通過加入含有或不含有抑制劑的酶來進行反應，反應15 min后，加入0.2 mL的1 mol/L HCl來終止反應，比較反應前后，該體系在290 nm處的吸光度改變。實驗分為空白對照組，陽性對照組和七葉蓮總皂苷低(200 μg/mL)、中(400 μg/mL)、高(800 μg/mL)劑量組，采用別嘌呤醇(30 μg/mL)作為陽性對照藥。

1.3 模型的建立、分組及干預 60只ICR小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組，模型對照組，陽性對照組，七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。陽性對照組小鼠按10 mg/kg的劑量給予別嘌呤醇溶液；七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組小鼠分別給予劑量為50、100、200 mg/kg的七葉蓮總皂苷提取液；正常對照組和模型對照組小鼠給予同體積0.3%羧甲基纖維素鈉水溶液。采用氧嗪酸鉀和乙胺丁醇造成小鼠高尿酸血癥病理模型。正常對照組小鼠使用PBS來代替，其它各組小鼠從第4天開始給予250 mg/(kg·d)乙胺丁醇(灌胃給藥)和 100 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀(腹腔注射)，連續(xù)造模給藥4天。在最后一次預處理1 h后，通過小鼠眼眥靜脈收集大約0.5 mL血液樣本，在4℃下放置1 h后，以10 000 g離心15 min獲得血清。同時取小鼠肝臟和腎臟一并冷凍保存待測。

1.4 小鼠體內尿酸濃度和黃嘌呤氧化酶活性測定用標準診斷試劑來測定血清中的尿酸濃度。在小鼠肝臟中黃嘌呤氧化酶的活性是通過分光光度法測定黃嘌呤生成尿酸的量來完成。0.5 g小鼠肝臟在1 mL 50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)中勻漿，在4℃條件下，以3 000 g離心10 min。除去脂質層之后，上清液在4℃條件下以10 000 rpm離心60 min。再次分離上清液用于測定黃嘌呤氧化酶活性與總蛋白濃度。50 mmol/L pH 7.4磷酸鈉緩沖液包含10 μL肝組織勻漿和0.54 mL 1 mmol/L的氧嗪酸鉀溶液，并在35℃下預孵15 min，加入0.12 mL 250 mmol/L黃嘌呤溶液。分別在0和30 min時，加入0.1 mL 0.6 mol/L HCl終止反應。并以3 000 g離心5 min，測定上清液在295 nm處的吸光度值?？偟鞍诐舛扔肔owry法來測定。黃嘌呤氧化酶的活性用每毫克蛋白質每分鐘形成尿酸的微摩爾數(shù)來表示。

1.5 小鼠腎臟URAT1的蛋白表達水平 采用Western blot法測定小鼠腎臟URAT1的蛋白表達水平。取小鼠腎皮層組織以含PMSF的裂解液RIPA提取蛋白，再以Lowry蛋白濃度測定試劑盒測定濃度。上述蛋白經10%的SDS-PAGE電泳分離后，在200 mA條件下轉移到PVDF膜上(2 h)，以5%的脫脂奶粉封閉 1 h后，一抗 URAT1(1∶1 000)和內參β-actin(1∶5 000)，4℃孵育過夜。再以HRP標記二抗(1∶5 000)孵育1 h，顯色后采用WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)軟件Gelpro32分析膠片中的Western blot蛋白條帶中的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS20.0軟件，計量資料以(x±s)表示，顯著性檢驗采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 體外黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用比較 見表1。與空白對照組比較，陽性對照組及七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組能夠顯著地抑制黃嘌呤氧化酶的活性(P＜0.05)。隨著七葉蓮總皂苷濃度的上升，其對黃嘌呤氧化酶活性抑制作用也顯著上升(P＜0.05)。本實驗為在體外建立的黃嘌呤氧化酶活性測定體系，獨立于后面的動物實驗，未造模，不設模型對照組。

表1 體外黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用比較(x±s)

2.2 各組小鼠體內血清尿酸水平比較 見表2。與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清尿酸水平顯著升高(P＜0.05)。與模型對照組比較，陽性對照組、七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組小鼠的血清尿酸水平顯著降低(P＜0.05)，具有一定的劑量依賴性。

2.3 各組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性比較 見表3。與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶的活性沒有明顯的差異。與模型對照組比較，陽性對照組、七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組小鼠的肝臟黃嘌呤氧化酶活性顯著降低(P＜0.05)，具有一定的劑量依賴性。

2.4 各組小鼠腎臟URAT1的蛋白表達水平比較 見表4。與正常對照組比較，模型對照組小鼠腎臟URAT1蛋白表達水平顯著上升(P＜0.05)。與模型對照組比較，陽性對照組，七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組小鼠的腎臟URAT1蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)。

表2 各組小鼠體內血清尿酸水平比較(x±s)

表3 各組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性比較(x±s)

表4 各組小鼠腎臟URAT1的蛋白表達水平比較(x±s)

3 討論

高尿酸血癥是以血液中具有較高水平的尿酸為特征的一種疾病。一般來說，高尿酸血癥和痛風的主要原因是嘌呤代謝紊亂，黃嘌呤經酶催化從而過度產生尿酸[10]。高尿酸血癥主要由腎排泄尿酸降低或過多的肝尿酸生成引起。在肝臟，黃嘌呤氧化酶可以催化次黃嘌呤氧化成黃嘌呤，進而黃嘌呤氧化成尿酸。此外，痛風與嘌呤降解的終產物即血清尿酸水平升高有關[11]。血清尿酸水平的高低是關節(jié)和腎臟尿酸鹽結晶沉積的最重要風險因素，有可能會導致尿路結石和痛風關節(jié)炎[12]。此前，許多中藥成分[11，13～14]已被證明具有較高黃嘌呤氧化酶抑制活性和降低血清尿酸水平的能力。

本研究通過評估血清尿酸水平、肝臟黃嘌呤氧化酶活性和腎臟尿酸轉運蛋白表達水平來研究七葉蓮總皂苷抗高尿酸血癥的作用。體外研究結果顯示，七葉蓮總皂苷低、中、高劑量均能抑制黃嘌呤氧化酶活性，并隨劑量的增加，抑制作用逐漸增強。體內研究中，與正常對照組小鼠相比，高尿酸模型小鼠的血清尿酸水平顯著升高，表明高尿酸血癥的小鼠模型復制成功。比較正常對照組和模型對照組小鼠的肝臟黃嘌呤氧化酶的活性，沒有發(fā)現(xiàn)顯著區(qū)別。這一結果表明用本研究造模方法可能不影響小鼠的黃嘌呤氧化酶活性。七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組小鼠的血清尿酸水平、肝臟黃嘌呤氧化酶活性及腎臟尿酸轉運蛋白URAT1表達均較模型組低，并均呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

可見，七葉蓮總皂苷可以通過抑制黃嘌呤氧化酶活性和降低腎臟尿酸轉運蛋白URAT1表達兩種途徑發(fā)揮降尿酸的作用。該結果為七葉蓮作為降尿酸中藥的開發(fā)利用奠定了一定基礎。

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