雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定藥物及生物樣品中呋塞米

王 芳， 秦節(jié)紅， 譚建紅， 江 虹

(長(zhǎng)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 408100)

呋塞米(Furosemide，F(xiàn)UR)又叫速尿，它是一種強(qiáng)效利尿藥，主要用于治療充血性心力衰竭、肝硬化、腎炎、腎病及各種原因所致的急、慢性腎功能衰竭等水腫性疾病。在臨床治療中，呋塞米用量越大，效果越好，但毒副作用增大，如惡心、腹瀉、藥疹、瘙癢、視力模糊、眩暈、乏力、疲倦、肌肉痙攣、口渴等，若長(zhǎng)期使用或過量使用將會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)K+、Cl-、Ca2+、Mg2+等電解質(zhì)減少，致使腎臟代謝失衡。另外，呋塞米還是體育比賽中國(guó)際禁用的興奮劑?？梢姡蝗椎挠昧颗c療效有著很大關(guān)系，故研究呋塞米含量的檢測(cè)方法有著重要意義。

目前，測(cè)定呋塞米的方法有滴定分析法[1]、高效液相色譜法[2 - 3]、紫外-可見分光光度法[4 - 5]、熒光法[6]、共振瑞利散射法[7]、化學(xué)發(fā)光法[8]及電化學(xué)法[9]等。本工作用維多利亞藍(lán)B(Vitoria Blue B,VB)在酸性條件下與FUR直接作用，生成離子締合物，其吸光度與一定質(zhì)量濃度的FUR呈線性關(guān)系，服從比爾定律。該法的靈敏度比文獻(xiàn)報(bào)道[4]中多數(shù)體系高，且方法更為簡(jiǎn)便，還可節(jié)省試劑。方法用于市售FUR藥物及人體血液、尿液中FUR的測(cè)定，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

U-3010型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，日立公司)；pHS -3C精密酸度計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司)。

維多利亞藍(lán)B(VB,上海源葉生物科技有限公司)溶液：1.0×10-3mol/L。呋塞米(FUR,重慶藥檢所提供)標(biāo)準(zhǔn)溶液：330.8 mg/L，冰箱4 ℃保存，取此溶液稀釋10倍即為操作液。Tris-HCl緩沖溶液：用0.10 mol/L的HCl和0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度計(jì)測(cè)定，配成pH=3.0～9.5的系列緩沖溶液。以上試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸鎦水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL具塞比色管中，依次加入1.0 mL pH=3.05 Tris-HCl緩沖溶液，適量的33.08 mg/L FUR標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣液，再加入2.0 mL 1.0×10-3mol/L VB溶液，用水稀至刻度，搖勻，靜置5 min后，用1 cm比色皿，以試劑空白為參比，采用雙波長(zhǎng)疊加法(以655 nm作參比波長(zhǎng)，625 nm作測(cè)定波長(zhǎng))測(cè)定溶液的吸光度A。

2 結(jié)果與討論

圖1 吸收光譜 Fig.1 The absorption spectra 1.3.31 mg/L FUR,against water;2.2.0×10-5 mol/L VB,against water;3-5(1.65,3.31,4.96 mg/L)FUR-2.0×10-4 mol/L VB,against reagent blank;pH=3.05 Tris-HCl.

2.1 FUR-VB光譜特征

按實(shí)驗(yàn)方法研究了可見光區(qū)FUR與VB的顯色反應(yīng)(圖1)。結(jié)果表明，F(xiàn)UR在可見光區(qū)幾乎無吸收(曲線1)，而VB在可見光區(qū)有較強(qiáng)吸收(曲線2)，最大吸收波長(zhǎng)為615 nm。當(dāng)在FUR的酸性溶液中加入VB溶液后，吸收曲線上出現(xiàn)明顯的正、負(fù)吸收峰，最大正吸收峰位于波長(zhǎng)625 nm處，紅移10 nm，最大負(fù)吸收峰位于655 nm波長(zhǎng)處，紅移40 nm?？梢?，F(xiàn)UR與VB在酸性條件下反應(yīng)生成了新物質(zhì)。當(dāng)以雙波長(zhǎng)疊加法測(cè)定時(shí)，吸光度與一定濃度范圍的FUR呈線性關(guān)系，服從比爾定律，故用雙波長(zhǎng)疊加法可以定量測(cè)定FUR的含量。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1溶液pH值室溫下，考察了Tris-HCl、HAc-NaAc及B-R緩沖溶液對(duì)締合反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，使用Tris-HCl緩沖溶液的效果相對(duì)較好。同時(shí)，考察了Tris-HCl緩沖溶液pH值對(duì)締合反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，締合反應(yīng)適宜的酸度范圍是pH=3.0～6.5，在此范圍內(nèi)，體系有較大靈敏度。實(shí)驗(yàn)選用pH=3.05 Tris-HCl緩沖溶液，用量以1.0 mL為宜。

2.2.2VB溶液的濃度室溫下，考察了VB溶液濃度對(duì)締合反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：適宜的VB溶液濃度為2.0×10-4mol/L。在此濃度下，締合物的吸光度可達(dá)最大且穩(wěn)定，VB濃度過高或過低，都將導(dǎo)致吸光度降低。當(dāng)VB溶液濃度過低時(shí)，締合反應(yīng)不完全，體系吸光度值降低；當(dāng)VB溶液濃度過大時(shí)，由于其自身的聚集作用而影響締合物的形成，從而使體系的吸光度值降低。實(shí)驗(yàn)選用1.0×10-3mol/L VB溶液，用量為2.0 mL。

2.2.3試劑加入順序室溫下，考察了FUR、VB及Tris-HCl溶液在不同加入順序時(shí)對(duì)締合反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，按1.2節(jié)中的加入順序，締合物的吸光度相對(duì)較好，體系靈敏度較高。

2.2.4反應(yīng)時(shí)間與穩(wěn)定性室溫下，考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系靈敏度的影響。結(jié)果表明：VB與FUR在5 min 內(nèi)即可反應(yīng)完全，其穩(wěn)定時(shí)間至少1.5 h。實(shí)驗(yàn)選在5 min后測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按實(shí)驗(yàn)方法配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液并掃描吸收光譜，繪制A-c標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法的一元線性回歸方程為:A=0.00797+0.07205c(c：mg/L)，相關(guān)系數(shù)r=0.9993。方法線性范圍為0.27～5.0 mg/L，檢出限為0.045 mg/L，表觀摩爾吸光系數(shù)ε=2.46×104L/(mol·cm)。

2.4 方法的選擇性

2.5 分析應(yīng)用

2.5.1樣液的制備取上海禾豐制藥有限公司的FUR注射液3支，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)入1 000 mL容量瓶中，用水稀至刻度，搖勻，即得待測(cè)液1#。取重慶涪陵中心醫(yī)院提供的新鮮人體血樣適量，以4 000 r/min離心分離20 min，取上清液1.0 mL于離心管中，加入2.0 mL甲醇，搖勻，離心分離10 min，將離心液用水定容至25.0 mL，即得待測(cè)液2#。取健康學(xué)生的新鮮尿液(3#)和服用FUR后2～3 h的病人尿液(4#)，過濾，即得待測(cè)液。

2.5.2樣液的測(cè)定取1#樣液0.5 mL，2#樣液2.0 mL，3#和4#樣液各4.0 mL，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度，各平行測(cè)定5份，同時(shí)作加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 樣品分析結(jié)果及回收試驗(yàn)(n=5)Table 1 Analytical results of samples and recovery tests(n=5)

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3 結(jié)論

用VB作探針的雙波長(zhǎng)疊加分光光度法，可以快速測(cè)定藥物及人體尿液、血液中的FUR含量。方法簡(jiǎn)便易行，有較高的準(zhǔn)確度和精密度，線性范圍較寬，選擇性較好，靈敏度能滿足分析要求。

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