黃芩苷在Nb2O5-石墨烯納米復(fù)合材料修飾電極上的電化學(xué)行為及測(cè)定

瞿萬云， 吳 艷,2， 胡衛(wèi)兵

(1.湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北恩施 445000)

黃芩苷(Baicalin,Bai)是中藥黃芩(RadixScutellariae)中主要的活性成分之一，它具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)靜解熱和抗癌等作用。研究表明，黃芩苷在低于細(xì)胞毒濃度時(shí)可抑制T細(xì)胞和艾滋病病毒，因此有望開發(fā)成為新的抗艾滋病藥物。目前，許多含黃芩的中藥復(fù)方制劑均采用黃芩苷作為質(zhì)量控制的指標(biāo)。因此，黃芩苷的測(cè)定在藥物質(zhì)量控制上十分重要。已報(bào)道測(cè)定黃芩苷的方法主要有高效液相色譜法[1]、毛細(xì)管電泳法[2]和電化學(xué)方法[3 - 6]等。其中，電化學(xué)分析方法以其儀器簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛研究。

石墨烯憑借優(yōu)良的電子傳輸能力、大的比表面積以及良好的生物相容性，已廣泛應(yīng)用于電分析化學(xué)領(lǐng)域[7 - 8]。石墨烯基復(fù)合材料借助不同材料的協(xié)同作用，具有更快的電子遷移率、更大的比表面積和更好的生物相容性。近年來，以石墨烯作為載體材料，合成石墨烯-金屬納米粒子和石墨烯-金屬氧化物復(fù)合材料，用于電化學(xué)和生物傳感領(lǐng)域的報(bào)道越來越多。例如，MnO2-石墨烯[9]、ZnO-石墨烯[10]、TiO2-石墨烯[11]、WO3-RGO[12]等。Nb2O5耐酸堿腐蝕性強(qiáng)，具有穩(wěn)定優(yōu)越的電化學(xué)性能[13]，Nb2O5-石墨烯(Nb2O5-RGO)納米復(fù)合材料用于黃芩苷的檢測(cè)尚未見報(bào)道。

本文采用一步溶劑熱法合成Nb2O5-RGO納米復(fù)合材料，并用其作修飾劑制備Nb2O5-RGO修飾玻碳電極。詳細(xì)研究了黃芩苷在該修飾電極上的電化學(xué)行為，發(fā)現(xiàn)Nb2O5-RGO修飾電極對(duì)黃芩苷具有良好的電催化活性。基于此，建立了黃芩顆粒制劑中黃芩苷的檢測(cè)新方法，為提高含黃芩的中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司),三電極系統(tǒng):工作電極為玻碳電極(GCE，Φ=3 mm)或修飾電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對(duì)電極為鉑絲電極；JSM-650LV型掃描電子顯微鏡(日本，電子株式會(huì)社)。

黃芩苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所)標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取一定量黃芩苷溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，配制成1.0×10-2mol·L-1的儲(chǔ)備液，置于冰箱中避光保存，使用時(shí)適當(dāng)稀釋；鱗片石墨(>99.98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；NbCl5(99.99%，Sigma-Aldrich公司)；雙十六烷基磷酸(DHP，F(xiàn)luka公司)。其他試劑均為分析純，所有試劑未經(jīng)純化直接使用。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

黃芩顆粒(某制藥有限公司)。

1.2 Nb2O5納米棒、RGO和Nb2O5-RGO材料的制備

用鱗片石墨為原料，采用改進(jìn)的Hummers方法[14]制備氧化石墨。稱取100 mg氧化石墨于50 mL二次蒸餾水中，超聲30 min后，離心分離即得氧化石墨烯(GO)分散液。

將25 mg NbCl5用少量無水乙醇溶解。把上述GO分散液和NbCl5乙醇溶液加入到100 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜內(nèi)襯中，反應(yīng)釜置于不銹鋼外殼中擰緊蓋好，于235 ℃保溫72 h，得到黑色的Nb2O5-RGO復(fù)合材料。同時(shí)，分別將單一的GO分散液和NbCl5乙醇溶液轉(zhuǎn)入到100 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜內(nèi)襯中，于235 ℃保溫72 h，得到黑色的RGO懸浮液[15]和Nb2O5納米材料[13]。上述產(chǎn)物分別用水、乙醇和丙酮各離心洗滌三次，60 ℃真空干燥得到Nb2O5-RGO、RGO和Nb2O5粉末。

1.3 修飾電極的制備

將4 mg Nb2O5-RGO和2 mg DHP加至4 mL水中，超聲分散40 min直至得到均一、黑色的懸浮液。GCE用粒徑為0.05 μm的Al2O3拋光粉進(jìn)行拋光，沖洗干凈后分別在無水乙醇、水中各超聲清洗2 min，紅外燈下烘干。取10 μL上述Nb2O5-RGO分散液滴加至GCE表面，紅外燈下?lián)]發(fā)掉溶劑即得到Nb2O5-RGO/DHP/GCE。Nb2O5-DHP/GCE和RGO-DHP/GCE參照上述方法制備。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

修飾電極先在10 mL pH=2.1的B-R緩沖溶液中循環(huán)伏安掃描(掃描范圍為0.0～1.0 V)，直至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定。然后，加入一定量的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，在攪拌條件下開路富集2 min，靜止15 s，在0.1～0.9 V之間進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)、線性掃描伏安(LSV)和差分脈沖伏安(DPV)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Nb2O5和Nb2O5-RGO材料的表征

用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)制備的Nb2O5和Nb2O5-RGO材料進(jìn)行表征，見圖1。從圖1a中可以看出Nb2O5納米棒的形貌；由圖1b可以清晰看到在RGO里分散有Nb2O5納米棒，且納米棒長(zhǎng)度為2.1 μm左右，直徑為400 nm左右。

圖1 Nb2O5(a)和Nb2O5-RGO(b)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM image of Nb2O5 (a) and Nb2O5-RGO(b)

圖2 黃芩苷在不同電極上的循環(huán)伏安圖 Fig.2 Cyclic voltammograms of the different modified electrodes in 5.0×10-6 mol·L-1 baicalin solutiona:Nb2O5-RGO/DHP/GCE in pH=2.1 B-R buffer solution without baicalin;b:Nb2O5-RGO/DHP/GCE;c:bare GCE;d:Nb2O5-DHP/GCE;e:RGO-DHP/GCE.scan rate:0.1 V·s-1；t=120 s .

2.2 黃芩苷在Nb2O5-RGO-DHP/GCE上的電化學(xué)行為

黃芩苷在不同電極上的CV曲線見圖2。在0.1 V到0.9 V的掃描范圍內(nèi)，黃芩苷在RGO-DHP/GCE(內(nèi)插圖曲線e)上沒有觀察到電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)；在裸GCE(內(nèi)插圖曲線c)和Nb2O5-DHP/GCE(內(nèi)插圖曲線d)上開路富集2 min后出現(xiàn)較小的氧化峰，說明這兩種電極對(duì)黃芩苷的電化學(xué)氧化活性較低；在Nb2O5-RGO/DHP/GCE(曲線b)上出現(xiàn)了一對(duì)靈敏的氧化還原峰(曲線a是Nb2O5-RGO/DHP/GCE在空白B-R緩沖溶液中)，峰電位差為45 mV，峰電流之比(Ipa/Ipc)為2.29，表明黃芩苷在Nb2O5-RGO/DHP/GCE上的反應(yīng)為準(zhǔn)可逆的電化學(xué)過程；而氧化峰電位比在裸GCE上正移了13 mV，氧化峰電流增大約18倍，說明Nb2O5-RGO復(fù)合材料能顯著增強(qiáng)黃芩苷的電氧化活性。這可能是由于Nb2O5納米棒分散在RGO里時(shí)阻止了氧化石墨烯在還原過程中的團(tuán)聚和堆疊，使復(fù)合材料具有較大的比表面積，為黃芩苷的氧化提供了較多的反應(yīng)位點(diǎn)；也有可能是復(fù)合材料中的RGO和Nb2O5產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，有效促進(jìn)了電子的傳輸速率，從而提高了黃芩苷的電氧化活性。另外，隨著掃描次數(shù)的增加，氧化峰電流逐漸降低，最后趨于穩(wěn)定；還原峰隨掃描次數(shù)增加略有降低，說明黃芩苷及其氧化產(chǎn)物在修飾電極上均有吸附。因此，為了得到更好的靈敏度和重現(xiàn)性，選擇第一圈的氧化峰作為研究對(duì)象。

2.3 影響黃芩苷電化學(xué)行為的因素

2.3.1測(cè)定介質(zhì)及pH值的影響用CV法研究了黃芩苷在HClO4、NaAc-HAc緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液、B-R緩沖溶液和NaOH溶液(濃度均為0.1 mol·L-1)中的電化學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在堿性溶液中無峰出現(xiàn)，在酸性溶液中有明顯的氧化峰出現(xiàn)，且在B-R緩沖液中的峰形較好，峰電流較大。在B-R緩沖溶液中，用LSV法研究了pH值對(duì)黃芩苷氧化峰電流的影響。發(fā)現(xiàn)pH在1.98～2.21范圍內(nèi)，黃芩苷的氧化峰電流幾乎不變；當(dāng)pH值繼續(xù)增加時(shí)，氧化峰電流逐漸減小。所以實(shí)驗(yàn)選擇pH=2.1的B-R緩沖溶液為測(cè)定介質(zhì)。另外，隨著pH的增加，黃芩苷的氧化峰電位逐漸負(fù)移，這表明質(zhì)子參與了黃芩苷的氧化過程。峰電位與pH值的關(guān)系為:EP(V)=0.5742-0.04871pH(R=0.9930),斜率48.71 mV/pH,說明參加氧化反應(yīng)的電子數(shù)和質(zhì)子數(shù)之比為1，這與文獻(xiàn)報(bào)道[4 - 5]的結(jié)果相似。

2.3.2掃描速率的影響用CV法考察了掃描速率對(duì)黃芩苷峰電流的影響，見圖3。黃芩苷在修飾電極上的氧化還原峰電流都隨掃速的增加而增大，而且在0.025～0.25 V·s-1范圍內(nèi)，氧化峰電流(Ip)與掃速(v)呈良好的線性關(guān)系(圖3插圖)，線性回歸方程為：Ip(μA)=2.5593+57.3319v(V·s-1)(R=0.9947)，表明黃芩苷在此修飾電極上的反應(yīng)是受吸附控制的。當(dāng)掃速為0.1 V·s-1時(shí)信噪比最好，所以本實(shí)驗(yàn)選擇掃速0.1 V·s-1。

另外，黃芩苷的氧化還原峰電位也隨掃速的改變而改變。隨掃速的增加，黃芩苷的氧化峰電位正移而還原峰電位負(fù)移，說明黃芩苷的氧化還原可逆性隨掃速的增大而變差。氧化峰電位與掃速的線性關(guān)系為：Ep(V)=0.5101+0.01561lnv(V·s-1)(R=0.9953)。對(duì)于受吸附控制的非可逆反應(yīng),氧化峰電位(Ep)與掃描速度(v)遵循以下關(guān)系式：Ep=E0+(RT/anaF)ln(RTk0/αnaF)+(RT/αnaF)lnv,Ep的斜率為RT/αnaF，其中na為轉(zhuǎn)移電子數(shù)，α為電子轉(zhuǎn)移系數(shù)，對(duì)于非可逆過程，α通常取0.5，由此求出na=1.7。故有兩個(gè)電子參與電極反應(yīng)，與文獻(xiàn)報(bào)道[4 - 5]的結(jié)果一致。

2.3.3Nb2O5-RGO用量的影響Nb2O5-RGO的用量對(duì)黃芩苷的氧化峰電流有很大的影響。當(dāng)Nb2O5-RGO分散液的量從0逐漸增加到10 μL時(shí)，黃芩苷的氧化峰電流顯著增加；從10 μL增加到15 μL的過程中，黃芩苷的氧化峰電流沒有明顯變化；繼續(xù)增加Nb2O5-RGO分散液的量，則峰電流反而降低?？赡苁且?yàn)榇藭r(shí)電極表面的DHP太多，降低了電極表面膜的導(dǎo)電性能，從而阻礙了黃芩苷與電極之間的電子交換。因此實(shí)驗(yàn)選擇Nb2O5-RGO分散液的用量為10 μL。

2.3.4富集時(shí)間和富集電位的影響分別試驗(yàn)了開路富集和閉路富集(富集電位-0.2～0.2 V范圍)情況下富集時(shí)間對(duì)黃芩苷氧化峰電流的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，峰電流隨富集時(shí)間的增加而增大，在相同富集時(shí)間條件下，開路富集的峰電流大于閉路富集的峰電流，故實(shí)驗(yàn)選擇開路富集。在開路富集條件下，對(duì)不同濃度的黃芩苷溶液進(jìn)行了攪拌富集時(shí)間試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，濃度為5.0×10-7mol·L-1的溶液富集3 min后峰電流達(dá)到最大值，而濃度為2.0×10-6mol·L-1的溶液富集2 min后就達(dá)到最大峰電流。說明黃芩苷在Nb2O5-RGO/DHP/GCE電極表面發(fā)生了吸附，濃度較小的溶液達(dá)吸附平衡所需時(shí)間較長(zhǎng)。

2.4 線性方程和檢出限

圖4 不同濃度黃芩苷的差分脈沖伏安曲線Fig.4 Differential pulse voltammograms of different concentrations of baicalin at Nb2O5-RGO/DHP/GCEcBai(a-j):0.05,0.1,0.5,0.7,1.0,2.5,5.0,7.5,10.0 mol·L-1.pH=2.1 B-R buffer solution;scan rate:40 mV·s-1.

在上述優(yōu)化條件下，用DPV法(脈沖振幅50 mV，電位增量4 mV，脈沖寬度0.04 s)考察了黃芩苷的氧化峰電流與其濃度的關(guān)系，見圖4。黃芩苷的氧化峰電流(IP)與其濃度(c)在5.0×10-8～1.0×10-6mol·L-1和1.5×10-6～1.0×10-5mol·L-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為：Ip(μA)=0.05846+7.8268c(c,μmol·L-1)(R=0.9979)；Ip(μA)=7.8237+2.5321c(c,μmol·L-1)(R=0.9978)，開路條件下富集3 min后，黃芩苷的檢出限(S/N=3)為1.5×10-8mol·L-1。

2.5 穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和選擇性

在最佳條件下，對(duì)1.0×10-6mol·L-1黃芩苷溶液平行測(cè)定5次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.6%；用5支修飾電極分別測(cè)定1.0×10-6mol·L-1的黃芩苷溶液，其RSD為4.8%，說明修飾電極具有良好的重現(xiàn)性。將制備好的修飾電極在4 ℃冰箱中分別放置1、2、4 d后再進(jìn)行測(cè)定，其氧化峰電流分別降低1.6%、3.5%、8.2%，說明該修飾電極有好的穩(wěn)定性。

在此體系中研究了一些常見金屬離子和有機(jī)物對(duì)黃芩苷測(cè)定的影響。1.0×10-3mol·L-1Zn2+、K+、Cu2+、Fe2+、Ca2+；1.0×10-5mol·L-1乳酸、尿酸、抗壞血酸、葡萄糖等幾乎不干擾2.0×10-6mol·L-1黃芩苷的測(cè)定(誤差<5%)。說明修飾電極有好的選擇性。

2.6 樣品分析及回收率的測(cè)定

取不同批號(hào)(批號(hào)：501640L、501630L、501644L)的黃芩顆粒制劑，分別研成細(xì)粉。稱取約0.5 g，精密稱定，用70%乙醇超聲提取兩次(每次20 mL，超聲30 min)，提取液過濾后置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。取一定體積的樣品溶液加入到10 mL電解池中，在最佳條件下進(jìn)行DPV測(cè)量。通過計(jì)算求得黃芩顆粒中黃芩苷含量分別為6.95%、7.12%和7.03%，平均值為7.03%。在該制劑中加入一定量的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法提取，提取液在優(yōu)化條件下連續(xù)測(cè)定4次，結(jié)果見表1。其回收率在93.0%～95.1%之間。

表1 黃芩苷的回收率測(cè)定結(jié)果(n=4)Table 1 Recovery results of baicalin in samples(n=4)

3 結(jié)論

本文用一步溶劑熱法制備了Nb2O5-RGO納米復(fù)合材料，制作了Nb2O5-RGO/DHP/GCE，用于黃芩苷的靈敏檢測(cè)。與裸GCE相比，黃芩苷在Nb2O5-RGO/DHP/GCE上的氧化峰電流顯著增強(qiáng)。Nb2O5-RGO/DHP/GCE有良好的穩(wěn)定性和選擇性，對(duì)黃芩苷的檢測(cè)具有較寬的線性范圍?？捎糜邳S芩顆粒制劑中黃芩苷的測(cè)定。

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