大體積樣品堆積-微乳液膠束電動(dòng)色譜法測定5種黃酮類化合物

蘇 慧， 齊燁迪， 林詩瑤， 賴 昕， 陳 莉，林振宇， 余麗雙*,

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122；2.福州大學(xué)食品安全分析與檢測教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350116)

黃酮類化合物是中草藥中普遍存在的有效成分，它是具有抗腫瘤、抗病毒、解痙抑菌、消炎止咳等生理活性的化合物[1]。現(xiàn)有的黃酮類化合物的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[2 - 5]和毛細(xì)管電泳法(CE)[6 - 9]。CE具有高效、快速、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已報(bào)道應(yīng)用于分離檢測黃酮類化合物的毛細(xì)管電泳分離模式有毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)[6]﹑膠束電動(dòng)色譜(MEKC)[7]、毛細(xì)管電色譜(CEC)[8]和微乳液膠束電動(dòng)色譜(MEEKC)[9]。目前，MEEKC已被廣泛應(yīng)用于分析天然產(chǎn)物[10 - 11]和環(huán)境樣品[12]等復(fù)雜樣品。但現(xiàn)有MEEKC法多使用紫外檢測器，靈敏度低，限制了其在痕量分析中的應(yīng)用。

為了提高分析方法的靈敏度，可將MEEKC法同在線富集技術(shù)聯(lián)用，目前常用的在線富集方法有常規(guī)樣品堆積法、大體積樣品堆積法和場放大樣品堆積法等。其中，常規(guī)樣品堆積法富集效果較低，場放大樣品堆積法只適合富集低鹽和無鹽樣品，而對于尿液等復(fù)雜高鹽樣品，富集效果不明顯。大體積樣品堆積法(LVSS)是通過壓力進(jìn)樣，使樣品溶液充滿5%～60%的毛細(xì)管，然后施加反向電壓將樣品基體不斷泵出管外以減小其基質(zhì)干擾，并產(chǎn)生樣品堆積作用，以提高檢測靈敏度[10,13 - 14]。 因此，大體積樣品堆積-微乳液膠束電動(dòng)色譜(LVSS-MEEKC)，適用于復(fù)雜生物樣品的痕量分析[10,14]。 至今尚未見利用LVSS-MEEKC同時(shí)分離檢測表兒茶素、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚5種黃酮類化合物的報(bào)道。本文采用LVSS-MEEKC法分離檢測表兒茶素、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚5種黃酮類化合物，結(jié)果表明方法富集效果良好，檢測限可低至ng/mL。建立的新方法成功用于人尿加標(biāo)樣品中上述5種黃酮類化合物的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Beckman PA800plus型毛細(xì)管電泳儀(美國，Beckman Coulter公司)，配二極管陣列檢測器及32Karat軟件；彈性未涂層石英毛細(xì)管(60 cm×75 μm，有效長度49 cm，永豐縣銳灃色譜器件有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；QL-861型渦旋儀(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；Starter 3C型pH酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；XS105型電子分析天平(梅特勒托利普國際股份有限公司)。

表兒茶素、槲皮苷、槲皮素對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；山奈酚對照品購自成都曼思特生物科技有限公司；木犀草素對照品購自Sigma生物制品有限公司。對照品純度均≥98%。對照品溶液：分別精密稱取表兒茶素、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚適量，加入無水乙醇溶解，配制成濃度為1 mg/mL的對照品儲備液。十二烷基硫酸鈉(SDS，Amresco)；無水乙醇、乙酸乙酯和正丁醇為色譜純試劑(上海阿拉丁試劑有限公司)；硼砂和NaH2PO4等試劑為分析純試劑，聚酰胺(30～60目)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。所有水均經(jīng)Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore公司)處理。

尿液來源于實(shí)驗(yàn)室成年男性志愿者,均為未服用任何藥物的空白尿液。

1.2 樣品處理

往空白人尿樣中分別加入高、中、低三種濃度水平的5種黃酮類化合物的混合對照品溶液，濃度分別為：表兒茶素0.08、0.1和0.12 μg/mL，槲皮苷、山奈酚、槲皮素、木犀草素均為0.04、0.05和0.06 μg/mL。隨后，將加標(biāo)尿樣置于離心機(jī)中，以2 000 r/min離心5 min。收集上清液，供LVSS -MEEKC分析。

1.3 電泳工作條件

新毛細(xì)管使用前分別用水、0.1 mol/L HCl、水、0.1 mol/L NaOH溶液、水各沖洗20 min。舊毛細(xì)管使用前分別用水、0.1 mol/L NaOH溶液、水、運(yùn)行緩沖溶液各沖洗8 min。MEEKC運(yùn)行緩沖溶液為：20 mmol/L硼砂-40 mmol/L NaH2PO4(pH=9.0)+0.3%SDS+2%正丁醇+1%乙酸乙酯。每次進(jìn)樣前，毛細(xì)管需用運(yùn)行緩沖溶液沖洗3 min。運(yùn)行電壓：20 kV，檢測波長：214 nm，壓力進(jìn)樣：20.7 kPa×55 s，堆積時(shí)間：1.25 min，操作溫度：25 ℃。

1.4 LVSS富集條件

LVSS最佳富集條件為：分離電壓20 kV，進(jìn)樣時(shí)間：20.7 kPa×55 s，堆積時(shí)間：1.25 min，堆積電壓：-20 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 MEEKC分離條件的優(yōu)化

2.1.1緩沖溶液的pH值優(yōu)化緩沖溶液的pH值對實(shí)驗(yàn)結(jié)果起著至關(guān)重要的作用。運(yùn)行緩沖液的pH值影響電滲流(EOF)及其分析物的總帶電量。實(shí)驗(yàn)中考察了pH在7.0～9.2范圍對5種黃酮類化合物分離效果的影響。由圖1可知：隨著pH值增大，山奈酚與木犀草素的分離度變大，木犀草素與槲皮素的分離度先變小后變大；當(dāng)pH值大于9.0，則表兒茶素的峰展寬；當(dāng)pH=9.0時(shí)，5種黃酮類化合物分離效果最佳，故選擇最佳pH為9.0。

2.1.2表面活性劑SDS濃度優(yōu)化在5 mmol/L 硼砂-10 mmol/L NaH2PO4(pH=9.0)條件下，對緩沖溶液中表面活性劑SDS含量進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，SDS含量超過0.5%，則系統(tǒng)出峰時(shí)間延長，EOF升高，毛細(xì)管柱內(nèi)焦耳熱增加明顯，嚴(yán)重影響分離效果。實(shí)驗(yàn)中考察了SDS含量在0.1%～0.5%范圍對分離效果產(chǎn)生的影響。SDS濃度過高，分離時(shí)間延長，SDS濃度太低，微乳液體系不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)最選擇是0.3%SDS。

2.1.3其他分離條件優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)還對助表面活性劑正丁醇等進(jìn)行考察。結(jié)果表明最佳緩沖溶液為：20 mmol/L硼砂-40 mmol/L NaH2PO4(pH=9.0)+3%SDS+2%正丁醇+1%乙酸乙酯。在以上條件下，5種黃酮類化合物得到很好的分離，見圖2(b)。

圖1 緩沖溶液pH值對分析物遷移行為的影響Fig.1 Effect of buffer pH on migration behavior of analytesRunning buffer:20 mmol/L borate-40 mmol/L phosphate buffer(pH=9.0) with 0.3% SDS,1% ethyl acetate,2% butyl alcohol.separation voltage:20 kV,detection wavelength:214 nm,hydrodynamic injection:3.4 kPa×6 s,temperature:25 ℃.pH:a.7.0;b.7.5;c.8.0;d.8.5;e.9.0;f.9.2.Peak identifications:1.L-Epicatechin;2.Quercitrin;3.Kaempferol;4.Luteolin;5,Quercetin.Sample concentration:10 μg/mL.

圖2 5種分析物的LVSS-MEEKC(a)和MEEKC(b)電泳圖Fig.2 Electropherograms of analytes by LVSS-MEEKC(a) and MEEKC(b)Running buffer:20 mmol/L borate-40 mmol/L phosphate buffer(pH=9.0) with 0.3% SDS,1% ethyl acetate,2% butylalcohol.Peak identification:1.L-Epicatechin;2.Quercitrin;3.Kaempferol;4.Luteolin;5,Quercetin.a:The sample concentration is 0.25 μg/mL;hydrodynamic injection:20.7 kPa×55 s;sample stacking time:20 kV×1.25 min；b:The sample concentration of 10 μg/mL;hydrodynamic injection:3.4 kPa×6 s.

2.2 LVSS條件優(yōu)化

2.2.1堆積時(shí)間的優(yōu)化在無限稀釋的樣品溶液中，堆積時(shí)間控制的是樣品基質(zhì)的排出。堆積時(shí)間過長，樣品離子會(huì)因泵出而損失；堆積時(shí)間過短，則富集效果不明顯或分離效率降低。當(dāng)施加堆積電壓時(shí)，電流值增大到分離電流最大值的90%～99%，應(yīng)立即停止施加電壓以確保最佳富集效果。采用-20 kV的堆積電壓，對不同堆積時(shí)間(0.9～1.5 min)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)堆積時(shí)間小于1.1 min時(shí)，分離效率較低。當(dāng)堆積時(shí)間達(dá)到1.4 min時(shí)，峰1(表兒茶素)消失，說明堆積時(shí)間過長，表兒茶素完全損失。進(jìn)而在1.1～1.4 min之間進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，選擇1.25 min作為最佳堆積時(shí)間。

2.2.2進(jìn)樣條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察了進(jìn)樣時(shí)間30～65 s時(shí)對樣品富集產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間小于50 s時(shí)，峰1的峰高小，富集效果差。隨著進(jìn)樣時(shí)間的延長，峰高增大，當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間大于60 s時(shí)，峰高近似不變，而峰形逐漸展寬，導(dǎo)致分離度下降。綜合考慮分離度和富集效果，選擇進(jìn)樣時(shí)間為55 s。

綜合上述，最佳LVSS條件為：分離電壓20 kV，進(jìn)樣時(shí)間：20.7 kPa×55 s，堆積時(shí)間：1.25 min，堆積電壓：-20 kV。在上述最佳的富集條件下，5種黃酮類化合物富集效果良好(圖2)。如圖2所示，利用常規(guī)MEEKC法測定5種黃酮類化合物(圖2(b)，分析物濃度為10 μg/mL)，其峰面積(除表兒茶素外)與分析物稀釋40倍后采用LVSS-MEEKC法(圖2(a)，分析物濃度為0.25 μg/mL)檢測的峰面積相近。以分析物富集前后峰面積比計(jì)算富集因子，5種分析物的富集因子在8～59之間，富集效果良好。相比其他4種分析物，表兒茶素富集因子為8較小，可能因?yàn)樵诜聪蚨逊e過程中表兒茶素遷移速度較其他4種分析物快，靠近進(jìn)樣端的部分表兒茶素被排出管外，造成損失，導(dǎo)致富集效果下降。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1線性關(guān)系、定量限和檢測限在圖2(a)所示實(shí)驗(yàn)條件下，對一系列不同濃度的對照品溶液進(jìn)行LVSS-MEEKC法測定，以各分析物的峰面積(Y)與對應(yīng)的濃度(X)進(jìn)行線性回歸，所得線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限(S/N=10)和檢測限(S/N=3)如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5種分析物在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限低至ng/mL級。

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn)取一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按圖2(a)中所示實(shí)驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定5次，計(jì)算峰面積和遷移時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，各分析物峰面積和遷移時(shí)間RSD均在5%范圍內(nèi)，表明方法的精密度良好。

表1 回歸方程、線性范圍及檢測限和定量限Table 1 Regression equation,linear range and detection limit (DLs) and quantitation limit(QLs)

圖3 空白尿樣(a)及加標(biāo)尿樣(b)的電泳圖Fig.3 The electropherogram of human blank urine(a) and spiked urine(b) by LVSS-MEEKC Peak numbers are same to that in Fig.1.

2.3.3加樣回收率實(shí)驗(yàn)按樣品處理方法制備人尿加標(biāo)樣品，在上述最佳富集和分離條件下，進(jìn)行模擬加標(biāo)尿樣實(shí)驗(yàn)，所得譜圖見圖3，所測得的回收率如表2所示。由圖3可知，空白尿樣對表兒茶素、槲皮素、木犀草素和山奈酚的測定無干擾，而槲皮苷因無法與空白尿樣中的內(nèi)源性物質(zhì)峰分離，無法測定。由表2可知，兒茶素、槲皮素、木犀草素和山奈酚4種黃酮類化合物的回收率范圍為92.50%～110.0%，RSD小于6.2%。

表2 人加標(biāo)尿樣的LVSS-MEEKC加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 The recovery experiment results of human spiked urine by LVSS-MEEKC(n=3)

3 結(jié)論

本文建立的LVSS-MEEKC法可同時(shí)分離檢測表兒茶素、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚5種黃酮類化合物。在最優(yōu)化的富集分離條件下，5種黃酮類化合物在12 min得到基線分離，且分析物的檢測限可低至ng/mL級。所建立的新方法可成功用于人加標(biāo)尿樣的測定。

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