人類皰疹病毒5型6型與扁平苔蘚相關性研究

王 君 陳官芝 管成飛 王瑩瑩

扁平苔蘚(lichen planus，LP)是一種慢性炎癥性皮膚病，常累及皮膚、甲、毛發(fā)和黏膜。皮膚扁平苔蘚(Cutaneous lichen planus, CLP)常侵犯四肢屈側(cè)皮膚?？谇槐馄教μ\(Oral LP，OLP)可以作為獨立的臨床癥狀出現(xiàn)，也可以伴發(fā)于皮膚扁平苔蘚或其他黏膜部位損害。LP的患病率約占人群的0.5%～2%，最常影響中年人(31～60歲)，男女發(fā)病率基本相等或女性稍多[1]。LP是一種自限性疾病，1個月～7年可消退。LP的病因和發(fā)病機制尚未完全明了，有關病因包括自身免疫、感染(細菌或病毒)、代謝和遺傳等。近年來病毒因素在LP發(fā)病中的作用引起了很多學者的重視，LP與人乳頭瘤病毒(HPV)、肝炎病毒、人類皰疹病毒(HHV)等相關的研究均有報道。目前的研究相對集中于口腔扁平苔蘚，對皮膚扁平苔蘚的研究相對較少。本研究應用Real Time PCR法檢測扁平苔蘚皮損組織及正常人皮膚組織中人類皰疹病毒5型6型的存在情況，探討此兩型病毒與扁平苔蘚發(fā)病的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集青島大學附屬醫(yī)院皮膚科2016年5月至2017年7月期間經(jīng)組織病理檢查確診的20例扁平苔蘚患者皮損組織標本，其中男9例，女11例，年齡23～62歲，平均(45.8±9.7)歲。另收集17名健康人美容外科手術(shù)正常皮膚組織，其中男8名，女9名，年齡25～58歲，平均(43.71±9.8)歲。兩組標本性別和年齡差異均無統(tǒng)計學意義。所有樣本保存于-80℃環(huán)境中。

1.2 試驗方法與步驟

1.2.1 DNA提取 取20例LP患者皮損及17名健康對照者皮膚組織(定量10 mg)，使用病毒DNA純化試劑盒(TaKaRa Code NO.9766，購自寶生物工程大連有限公司)，嚴格按照試劑盒操作步驟純化提取DNA。得到的DNA提取液置于-4℃環(huán)境中保存待用。

1.2.2 實時定量PCR檢測 采用Real Time PCR的Cycleave探針法。

1.2.2.2 標準曲線制作 用EASY Dilution將構(gòu)建的DNA標準品10倍梯度稀釋作為模板進行Real Time PCR反應，制作標準曲線(圖1～4)。

1.2.2.3 樣本HHV-5及HHV-6定量DNA檢測 采用Real Time PCR檢測樣本，記錄Ct值，計算HHV-5及HHV-6 DNA拷貝數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。扁平苔蘚組與對照組病毒檢測陽性率比較采用Fisher確切概率法(Fisher exact probability test)。兩組樣本陽性標本的DNA拷貝數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

兩組所有樣品進行HHV5基因檢測時均沒有擴增。20例扁平苔蘚皮損組織樣本中有16例(16/20,80%)HHV-6DNA擴增，17名健康人皮膚組織中有9名(9/17,52.94%)HHV-6DNA擴增，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，兩組樣本HHV-6陽性率差別無統(tǒng)計學意義(表1)。兩組中HHV-6陽性標本的DNA濃度(拷貝數(shù))間差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

圖1 HHV-5定量反應曲線

圖2 HHV-5定量標準曲線

圖3 HHV-6定量反應曲線

圖4 HHV-6定量標準曲線

表1 HHV-6實驗組與對照組陽性例數(shù)的組間比較

注：Fisher確切概率法(Fisher exact probability test)P>0.05

表2 兩組中HHV-6陽性樣本的DNA拷貝情況

注：t=0.509，P>0.05

3 討論

人類皰疹病毒5型(Human Herpesvirus 5, HHV-5，巨細胞病毒Cytomegalovirus，CMV)是DNA病毒，在人群中感染非常普遍，普通成人中45%～50%曾被HHV-5感染，幼年生活在貧困地區(qū)的人感染率甚至可以達到100%[2]。但大多數(shù)呈臨床不顯性感染或潛伏感染，單核細胞是HHV-5潛伏的載體之一[3]，HHV-5有嗜腺體細胞性，唾液是病毒釋放傳播的途徑。人類皰疹病毒6型(Human Herpesvirus 6,HHV-6)是1986年從艾滋病合并淋巴細胞增生性疾病患者的外周血單個核細胞中分離出的一種病毒。與其他皰疹病毒相似，急性感染恢復后，病毒可長期潛伏在體內(nèi)，一旦機體免疫力降低，病毒可激活致病。HHV-6是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一種可以將其DNA整合至宿主細胞染色體上的皰疹病毒。病毒可分為HHV-6A和HHV-6B兩型。HHV-6B的感染呈全球分布，據(jù)估計2歲以上人群的HHV-6抗體陽性率>95%[4]。在體外培養(yǎng)中，HHV-6可以感染T細胞、成纖維細胞、NK細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞等。

HHV-5及HHV-6的感染或再激活與許多疾病相關聯(lián)。有學者對HHV-5及HHV-6與口腔扁平苔蘚做了相關研究，結(jié)論尚有爭議。Ghodratnama等[5]在OLP患者黏膜組織中檢測到HHV-5DNA(2/20)、HHV-6DNA(4/20)及HHV-5、6DNA共同陽性，但沒有統(tǒng)計學意義，不能確定與OLP的發(fā)病有關聯(lián)。顧楊等檢測了OLP患者及健康對照者的不同標本中4種人類皰疹病毒DNA,發(fā)現(xiàn)HHV-5與OLP的發(fā)病相關聯(lián)，但HHV-6、HHV-7與OLP的發(fā)病關系不能確定[6]。人類皰疹病毒與皮膚扁平苔蘚(CLP)的關系研究較少，Nahidi等[7]的研究認為HHV-7與LP的發(fā)病相關。

在我們的研究中，所有組織樣本均未檢測到HHV-5DNA,推測扁平苔蘚的發(fā)病與HHV-5的局部感染無關。與顧楊等[6]對OLP的研究結(jié)果不一致，考慮可能的原因有：1)皮膚樣本DNA含量較低；2)HHV-5病毒不在皮膚組織中感染復制；3)HHV-5有嗜腺體細胞性，可能OLP與CLP在發(fā)病機制上存在不同的誘發(fā)因素。20例扁平苔蘚皮損樣本中有16例(16/20,80%)HHV-6DNA擴增，17名健康人皮膚組織中有9名(9/17,52.94%)HHV-6DNA擴增，CLP組陽性率高于健康對照組，但兩組樣本HHV-6陽性率差別無統(tǒng)計學意義。與Ghodratnama等[5]的研究結(jié)果類似。扁平苔蘚是一種病因復雜的免疫相關性疾病，誘發(fā)因素很多。包括人類皰疹病毒在內(nèi)的很多感染因素在誘發(fā)扁平苔蘚發(fā)病過程中所扮演的角色有待進一步研究。

[1] Bhattaeharya M，Kaur I，Kumar B．Lichen planus：a clinical and epidemiologieal study[J].J Dermatol，2000，27(9)：576-582.

[2] Mustakangas P, Sarna S, Ammala P, et al.Human cytomegalovirus seroprevalence in three socioeconomically different urban areas during the first trimester:a population-based cohort study[J].Int J Epidemiol,2000,29(3):587-591.

[3] 金奇.醫(yī)學分子病毒學[M].北京：科學出版社，2001.716.

[4] Hall C.The epidemiology of human herpesvirus 6(HHV6)[J].J Clin Virol,2006,37(2):103.

[5] Ghodratnama F, Riggio MP, Wray D.Search for human herpesvirus 6, human cytomegalovirus and varicella zoster virus DNA in recurrent aphthous stomatitis tissue[J].J Oral Pathol Med,1997,26(4):192-197.

[6] 顧楊，李晶泉，李明漢，等.人類皰疹病毒5～8型與口腔扁平苔蘚發(fā)病間的關系[J].國際口腔醫(yī)學雜志,2010,37(4):386-391.

[7] Nahidi Y, Tayyebi MN, Ghazvini K, et al.Association of classic lichen planus with human herpesvirus-7 infection[J].Int J Dermatol,2017,56(1):49-53.