大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠高分辨力擴(kuò)散張量纖維束示蹤成像研究

曹宸 張雪君 韓彤

腦卒中發(fā)病率、病殘率和病死率均較高，約80%的腦卒中系血管堵塞引起的腦缺血所致［1?2］，因此，建立操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性佳、接近人類的活體腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ褪茄芯咳毖宰渲胁±砩韺W(xué)機(jī)制和預(yù)防與治療措施的重要基本條件。大鼠是模擬人類缺血性卒中的首選對(duì)象，雖然大鼠腦組織體積小、白質(zhì)纖維遠(yuǎn)不如人類發(fā)達(dá)，但相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)［3］。隨著高分辨力MRI的出現(xiàn)，使得MRI可以從結(jié)構(gòu)和功能上準(zhǔn)確、直觀地觀察缺血后腦組織結(jié)構(gòu)變化。高場(chǎng)強(qiáng)（7.0T）MRI圖像質(zhì)量顯著提高，除增加信噪比（SNR）外，還顯著縮短掃描時(shí)間，尤其對(duì)于擴(kuò)散張量成像（DTI）而言，采集方向的增加和分辨力的提高獲得更強(qiáng)的擴(kuò)散信號(hào)，圖像時(shí)間分辨力和空間分辨力顯著提高，將不同腦組織之間的對(duì)比和細(xì)節(jié)顯示得更加清晰［4］。本研究對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型大鼠進(jìn)行高場(chǎng)強(qiáng)、高分辨力DTI和擴(kuò)散張量纖維束示蹤成像（DTT）掃描，以探討缺血性卒中梗死灶中心和周圍白質(zhì)纖維束損傷情況。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性Sprague?Dawley（SD）大鼠30只，周齡8周，體重250～300 g，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，于室溫18～26℃、相對(duì)濕度40%～70%、12 h晝-12 h夜循環(huán)照明環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

2.試劑與設(shè)備 PharmaScan 7.0T MRI掃描儀（美國(guó)Bruker公司）由首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心提供，孔徑16 cm，最大梯度場(chǎng)強(qiáng)300 mT/m，配備38 mm大鼠專用表面線圈。Diffusion Toolkit 0.6軟件和TrackVis 0.5.1軟件由美國(guó)Athinoula A.Martinos生物醫(yī)學(xué)影像中心開發(fā)（http://www.trackvis.org），DtiStudio 3.0.3軟件由美國(guó)F.M.Kirby腦功能影像研究中心開發(fā)（https://www.mristudio.org）。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科提供。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物模型制備與分組 30只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和大腦中動(dòng)脈閉塞模型組（MCAO組）。（1）對(duì)照組：10只大鼠，直接行MRI檢查。（2）MCAO組：20只大鼠，采用線拴法制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型，并于模型制備后0.50 h行擴(kuò)散加權(quán)成像（DWI）和神經(jīng)功能評(píng)分。DWI顯示梗死側(cè)明顯異常信號(hào)和神經(jīng)功能評(píng)分1～3分（0分，無神經(jīng)功能缺損，活動(dòng)正常；1分，對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展；2分，爬行時(shí)出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒；4分，不能行走，意識(shí)障礙；5分，死亡）者為模型制備成功。

2.MRI檢查 兩組大鼠分別于模型制備后3 h、6 h、1 d、2 d、3 d、4 d和 7 d行 MRI檢查。大鼠俯臥位，腹腔注射10%水合氯醛0.30 ml/100 g后以短木簽固定頭部并監(jiān)測(cè)心率和呼吸，行冠狀位掃描，掃描序列包括 T2WI、DWI和 DTI。（1）T2WI：重復(fù)時(shí)間（TR）3200 ms、回波時(shí)間（TE）15 ms，翻轉(zhuǎn)角（FA）180°，掃描視野（FOV）22 mm ×16 mm，矩陣256×256，激勵(lì)次數(shù)（NEX）為 1次，層厚 1 mm、層間距0.50 mm，共掃描 15層，掃描時(shí)間 102.64 s。（2）DWI序列：重復(fù)時(shí)間5500 ms、回波時(shí)間30 ms，翻轉(zhuǎn)角90°，掃描視野22 mm×16 mm，矩陣128×128，激勵(lì)次數(shù)1次，b值為200、400、600、800和1000 s/mm2，層厚1 mm、層間距0.50 mm，共掃描15層，掃描時(shí)間22 s。（3）DTI序列：重復(fù)時(shí)間為 4000 ms、回波時(shí)間24 ms，翻轉(zhuǎn)角 90°，掃描視野 22 mm ×16 mm，矩陣128×96，激勵(lì)次數(shù)1次，采集126個(gè)方向的擴(kuò)散加權(quán)，b值為1000 mm/s2，層厚1 mm、層間距0.50 mm，共掃描15層，掃描時(shí)間500 s。

3.圖像處理 采用Diffusion Toolkit 0.6軟件和DtiStudio 3.0.3軟件獲得大鼠頭部部分各向異性（FA）圖、平均擴(kuò)散率（MD）圖、軸向擴(kuò)散系數(shù)（λ║）圖和徑向擴(kuò)散系數(shù)（λ┴）圖，參照大鼠解剖圖譜，于梗死側(cè)皮質(zhì)、皮質(zhì)下和胼胝體分別選取大小約為2、2和1 mm2的興趣區(qū)（ROI），計(jì)算相應(yīng)FA值、MD值、λ║值和λ┴值。采用TrackVis 0.5.1軟件進(jìn)行DTT掃描，獲得三維神經(jīng)纖維圖，于內(nèi)囊區(qū)選取直徑2.50 mm的小球作為興趣區(qū)，計(jì)算纖維數(shù)目（NT）值并觀察其變化。

三、統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro?Wilk檢驗(yàn)，兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)皮質(zhì)、皮質(zhì)下和胼胝體FA值、MD值、λ║值、λ┴值和NT值的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較行LSD?t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

本研究隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組大鼠死亡5只，最終納入5只；MCAO組大鼠死亡10只，最終納入10只。兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)皮質(zhì)、皮質(zhì)下和胼胝體FA值（均P=0.000）、MD值（均P=0.000）、λ║值（均P=0.000）和λ┴值（均P=0.000）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1～6），其中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，MCAO組梗死側(cè)皮質(zhì)FA值于超急性期（≤6 h）緩慢升高（P=0.000）、急性期（6小時(shí)至3天）明顯下降（均P=0.000）、亞急性期（3天至8周）緩慢下降（均P=0.000）并趨于穩(wěn)定，MD值、λ║值和λ┴值均于超急性期無明顯變化（均P＞0.05）、急性期明顯升高（均P=0.000）、亞急性期緩慢升高（均P=0.000）并趨于穩(wěn)定；梗死側(cè)皮質(zhì)下FA值于超急性期緩慢升高（P=0.000）、急性期明顯下降（均P=0.000）、亞急性期有所升高但仍低于超急性期（均P=0.000）并趨于穩(wěn)定，MD值和λ║值均于超急性期無明顯變化（均P＞0.05）、急性期明顯升高（均P=0.000）、亞急性期緩慢升高（均P=0.000）并趨于穩(wěn)定，λ┴值于超急性期即明顯升高（均P=0.000）、急性期和亞急性期緩慢升高（均P=0.000）并趨于穩(wěn)定；梗死側(cè)胼胝體FA值于超急性期緩慢升高（P=0.000）、急性期明顯下降（均P=0.000）、亞急性期有所升高但仍低于超急性期（均P=0.000）并趨于穩(wěn)定，MD值、λ║值和λ┴值均于超急性期無明顯變化（均P＞0.05）、急性期明顯升高（均P=0.000）、亞急性期有所下降但仍高于超急性期（均P=0.000）并趨于穩(wěn)定。對(duì)照組與MCAO組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)、皮質(zhì)下和胼胝體FA值（P=0.003，0.000，0.000），皮質(zhì)下MD值（P=0.013），皮質(zhì)下和胼胝體λ║值（P=0.012，0.001）和λ┴值（P=0.001，0.036）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而皮質(zhì)MD值、λ║值和λ┴值以及胼胝體MD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1～6）。

兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)NT值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000；表7，8），其中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，MCAO組梗死側(cè)NT值于超急性期緩慢下降（P=0.032）、急性期明顯下降（均P=0.000）、亞急性期有所升高但仍低于超急性期（均P=0.000）并趨于穩(wěn)定。MCAO組大鼠各時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)NT值低于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000；表7，8）。

采用DTT分別對(duì)兩組大鼠梗死側(cè)和健側(cè)進(jìn)行白質(zhì)纖維束重建（圖1），結(jié)果顯示，對(duì)照組和MCAO組健側(cè)白質(zhì)纖維束走行自然，形態(tài)完整；MCAO組梗死側(cè)白質(zhì)纖維束走行迂曲，部分離斷，邊緣纖維仍保持相對(duì)正常，尤其模型制備1 d后，DTT即可見梗死側(cè)受損纖維趨于圍繞病灶邊緣（圖2）。

討 論

通過對(duì)DTI參數(shù)的綜合分析，可以看出缺血后腦組織的微觀變化［5?6］。FA值是定量評(píng)價(jià)各向異性的最常用參數(shù)，代表水分子各向異性成分占整個(gè)擴(kuò)散張量的比例［7］；MD值描述單個(gè)水分子的綜合微觀運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞毒性水腫可以導(dǎo)致該值降低［8?9］；λ║值和λ┴值分別代表體素中平行和垂直于纖維方向的擴(kuò)散系數(shù)，可以提供更詳細(xì)的擴(kuò)散方向信息。

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)皮質(zhì)FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 1. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in cortex of infarct side at different time points between 2 groups

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)皮質(zhì)FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 1. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in cortex of infarct side at different time points between 2 groups

MCAO，middle cerebral artery occlusion，大腦中動(dòng)脈閉塞；FA，fractional anisotropy，部分各向異性；MD，mean diffusion coefficient，平均擴(kuò)散率；λ║，axial diffusivity，軸向擴(kuò)散系數(shù)；λ┴，radial diffusivity，徑向擴(kuò)散系數(shù)

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表2 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)皮質(zhì)FA值、MD值、λ║值和λ┴值的重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析表Table 2. ANOVA of repeated measurement design of FA,MD,λ║ and λ┴ values in cortex of infarct side at different time points between 2 groups

正常人群白質(zhì)FA值高于灰質(zhì)，白質(zhì)內(nèi)為平行纖維，較灰質(zhì)結(jié)構(gòu)更加緊密，故白質(zhì)λ║值高于λ┴值，表明水分子平行軸突方向擴(kuò)散較垂直軸突方向更加自由，而灰質(zhì)λ┴值與λ║值差值較白質(zhì)小，這是由于灰質(zhì)水分子布朗運(yùn)動(dòng)限制較少，因此，λ║值和λ┴值反映出白質(zhì)與灰質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異，而MD值無法區(qū)分二者［10］。

在本研究中，腦缺血分為超急性期（≤6 h）、急性期（6小時(shí)至3天）和亞急性期（3天至8周），超急性期MCAO組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)（灰質(zhì)）、皮質(zhì)下（白質(zhì)）和胼胝體FA值緩慢升高，這是由于腦缺血致細(xì)胞毒性水腫，纖維髓鞘腫脹，纖維束間隙減小，但灰質(zhì)和白質(zhì)結(jié)構(gòu)小梁尚未破壞。既往的大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型研究顯示，腦缺血超急性期FA值呈現(xiàn)明顯不同改變，包括明顯升高、略升高、維持不變或降低［11?12］，多種因素可以導(dǎo)致上述差異，包括缺血原因、病變部位、嚴(yán)重程度和圖像質(zhì)量等。急性期MCAO組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)、皮質(zhì)下和胼胝體FA值明顯下降，皮質(zhì)MD值、λ┴值和λ║值升高，皮質(zhì)下λ║值和λ┴值明顯升高，尤以λ┴值顯著。這是由于梗死灶逐漸形成血管源性水腫，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血?腦屏障破壞，血管內(nèi)大分子物質(zhì)和水分子外滲至細(xì)胞外間隙，隨著這一過程的進(jìn)行性加重，灰質(zhì)和白質(zhì)結(jié)構(gòu)小梁均已破壞，導(dǎo)致FA值明顯下降。亞急性期大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)、皮質(zhì)下和胼胝體FA值仍緩慢下降或有所升高但仍低于超急性期并趨于穩(wěn)定，皮質(zhì)下λ┴值有所下降但仍高于超急性期并趨于穩(wěn)定，表明神經(jīng)纖維重塑已經(jīng)發(fā)生，這可能是由于增加的軸突和髓鞘導(dǎo)致的，也可能是由于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、瘢痕組織等形成的擴(kuò)散屏障導(dǎo)致的。

表3 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)皮質(zhì)下FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 3. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in subcortex of infarct side at different time points between 2 groups

表3 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)皮質(zhì)下FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 3. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in subcortex of infarct side at different time points between 2 groups

MCAO，middle cerebral artery occlusion，大腦中動(dòng)脈閉塞；FA，fractional anisotropy，部分各向異性；MD，mean diffusion coefficient，平均擴(kuò)散率；λ║，axial diffusivity，軸向擴(kuò)散系數(shù)；λ┴，radial diffusivity，徑向擴(kuò)散系數(shù)

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表4 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)皮質(zhì)下FA值、MD值、λ┴值和λ║值的重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析表Table 4. ANOVA of repeated measurement design of FA,MD,λ║ and λ┴ values in subcortex of infarct side at different time points between 2 groups

DTI技術(shù)可以利用水分子擴(kuò)散的各向異性進(jìn)行DTT成像，從三維立體角度顯示白質(zhì)纖維束走行方向及其完整性。本研究DTT掃描顯示，MCAO組大鼠梗死側(cè)興趣區(qū)纖維束分布較對(duì)側(cè)明顯稀疏，大部分纖維束卷曲、離斷；尤其模型制備1 d后，梗死側(cè)興趣區(qū)纖維束NT值即明顯下降，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NT值持續(xù)降低，表明腦缺血導(dǎo)致的髓鞘結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)喪失仍在繼續(xù)；至亞急性期，NT值有所升高，表明此時(shí)梗死側(cè)神經(jīng)纖維重塑已經(jīng)發(fā)生，這與DTI參數(shù)的綜合分析結(jié)果相符。本研究結(jié)果還顯示，模型制備1 d后MCAO組大鼠梗死側(cè)受損纖維趨于圍繞病灶邊緣，有助于抑制病灶向周圍侵襲，并促進(jìn)病灶恢復(fù)，對(duì)梗死灶的神經(jīng)纖維重塑具有重要作用。

表5 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)胼胝體FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 5. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in the corpus callosum of infarct side at different time points between 2 groups

表5 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)胼胝體FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 5. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in the corpus callosum of infarct side at different time points between 2 groups

MCAO，middle cerebral artery occlusion，大腦中動(dòng)脈閉塞；FA，fractional anisotropy，部分各向異性；MD，mean diffusion coefficient，平均擴(kuò)散率；λ║，axial diffusivity，軸向擴(kuò)散系數(shù)；λ┴，radial diffusivity，徑向擴(kuò)散系數(shù)

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表6 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)胼胝體FA值、MD值、λ║值和λ┴值的重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析表Table 6. ANOVA of repeated measurement design of FA,MD,λ║ and λ┴ values in corpous callosum of infarct side at different time points between 2 groups

靜脈溶栓是目前治療急性缺血性卒中的主要方法，但其治療時(shí)間窗較窄，多數(shù)患者僅能接受藥物治療和相關(guān)康復(fù)治療，治療方法相對(duì)有限［13］。對(duì)于缺血性卒中治療方法的研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)意義重大。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，腦缺血后進(jìn)行數(shù)周神經(jīng)康復(fù)治療，有助于神經(jīng)纖維重塑，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)；DTI顯示，治療組腦缺血邊緣FA值升高，DTT顯示，梗死灶周圍神經(jīng)纖維重塑；予神經(jīng)干細(xì)胞治療后，移植的神經(jīng)干細(xì)胞遷移至梗死灶邊緣地區(qū)［14?15］。亦有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提出“神經(jīng)血管單元”的概念［16］，認(rèn)為這是一種功能和結(jié)構(gòu)上相互依賴的多細(xì)胞復(fù)合體，包括神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和基底細(xì)胞，作為一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)維持穩(wěn)定的神經(jīng)元微環(huán)境［17?18］。因此認(rèn)為，藥物治療不應(yīng)僅關(guān)注神經(jīng)元功能的維持，還應(yīng)保護(hù)血管完整性及其他神經(jīng)血管單元成分，并通過DTI和動(dòng)脈自旋標(biāo)記（ASL）觀察藥物作用［19］。

表7 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)NT值的比較Table 7. Comparison of NT value of infarct side at different time points between 2 groups

表7 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)NT值的比較Table 7. Comparison of NT value of infarct side at different time points between 2 groups

MCAO，middle cerebral artery occlusion，大腦中動(dòng)脈閉塞

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表8 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死側(cè)NT值的重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析表Table 8. ANOVA of repeated measurement design of NT value of infarct side at different time points in 2 groups

圖1 頭部DTT掃描所見 1a 對(duì)照組大鼠白質(zhì)纖維束走行自然，形態(tài)完整 1b MCAO組大鼠健側(cè)白質(zhì)纖維束走行自然，形態(tài)完整；梗死側(cè)白質(zhì)纖維束走行迂曲，部分離斷 圖2 頭部DTT掃描顯示，MCAO組大鼠模型制備1 d后梗死側(cè)受損纖維趨于圍繞病灶邊緣Figure 1 Brain DTT findings The white matter fiber tracts in control group were normal and intact(Panel 1a).In MCAO group,the white matter fiber tracts in the affected side were twisted and disconnected,but the contralateral white matter fiber tracts were normal and intact(Panel 1b).Figure 2 Brain DTT showed the damaged fibers tended to be around the edge of lesion 1 d after MCAO model establishment.

神經(jīng)纖維重塑的解剖學(xué)基礎(chǔ)目前尚不清楚，推測(cè)有多種因素發(fā)揮重要作用。第一，為促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，重塑區(qū)可能發(fā)生軸突出芽，形成新的神經(jīng)元之間連接。第二，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生可能發(fā)揮重要作用，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生提高軸突的定向性。神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的溝通對(duì)軸突傳導(dǎo)、突觸傳遞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要作用，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控神經(jīng)元周圍環(huán)境，包括離子流量、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞間黏附分子（ICAM）、傳遞因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等，通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)及其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以影響神經(jīng)興奮性和突觸傳遞，并協(xié)調(diào)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活性。第三，受損的白質(zhì)纖維束圍繞病灶形成天然屏障，可以保護(hù)周圍尚未受損的腦組織，并使新生軸突進(jìn)入損傷區(qū)，促進(jìn)其在梗死灶邊緣重新建立新的連接［20］。

本研究采用高場(chǎng)強(qiáng)（7.0T）DTI和DTT技術(shù)對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠白質(zhì)纖維束進(jìn)行精細(xì)成像，克服小視野DTI成像分辨力不足的缺點(diǎn)，但尚待補(bǔ)充更大樣本量、更長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的影像學(xué)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行病理學(xué)檢查。

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