雙芳基酮還原酶的基因挖掘及催化性質(zhì)

唐銘燴 ， 許國超 ， 倪 曄 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

（R）-（4’-氯苯基）-（吡啶-2’-基）-甲醇[（R）-（4’-chlorophenyl） （pyridin-2’-yl）methanol， （R）-CPMA，C12H10ClNO]是一類重要的手性雙芳基甲醇，可作為關(guān)鍵手性中間體用于合成治療梅尼埃綜合癥、血管性頭痛、腦動脈硬化及急性缺血性腦血管等疾病的藥物，如抗組胺藥倍他司汀。鑒于手性（R）-CPMA和雙芳基甲醇廣泛的應(yīng)用價值，其高效、綠色地合成具有非常重要的意義。目前手性雙芳基甲醇的合成方法主要有對映選擇性拆分法、親和加成法和生物不對稱還原法，而由于生物不對稱還原法具有100%的理論得率、操作簡便、反應(yīng)條件溫和等特點被認(rèn)為是最具應(yīng)用潛力的合成方法之一[1-3]。

Corey EJ 等[4]發(fā)現(xiàn) CBS（Corey-Bakshi-Shibata）還原劑可用于雙芳基甲酮底物的不對稱還原，生成手性雙芳基甲醇，該法是目前為止具有最高對映選擇性的化學(xué)還原法。在-40℃條件下，手性硼雜惡唑烷（CBS催化劑）和兒茶酚硼烷的甲苯溶液可還原1-（4’-氯苯基）-（吡啶-2’-基）-甲酮（CPMK）生成（R）-CPMA，最終反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為78%，ee值為98%。但該方法的反應(yīng)溫度條件苛刻，對底物的要求高，才會具有高選擇性，因此適用范圍非常有限[1]。2007年，Truppo MD等篩選了一系列商品化酮還原酶KRED后，發(fā)現(xiàn)雖然有一些KRED對雙芳基酮底物有還原能力，但立體選擇性一般，僅KRED124可以不對稱還原10 g/L的CPMK生成（R）-CPMA，ee值為94%，轉(zhuǎn)化率98%[5]；2009年，Zhu DM等發(fā)現(xiàn)來源于Sporobolomyces salmonicolor的重組羰基還原酶SSCR及其突變體可以立體選擇性還原不同雙芳基酮底物 （8-99%ee）[6-7]，在葡萄糖脫氫酶的協(xié)助下，可還原 1-（4’-氯苯基）-1-苯基甲酮生成 1-（4’-氯苯基）-1-苯基甲醇，轉(zhuǎn)化率為62%，對映選擇性為 88%（R）；2012年，本研究室周婕妤等[8-9]通過傳統(tǒng)富集培養(yǎng)篩選到一株克魯維酵母Kluyveromycessp.CCTCCM2011385，可催化還原 CPMK 生成（S）-CPMA（87%ee），然而野生菌全細(xì)胞最高僅能催化2 g/L CPMK的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

作者采用基因組數(shù)據(jù)挖掘的策略，克隆了9個不同來源的假定雙芳基酮還原酶。經(jīng)功能篩選發(fā)現(xiàn)來源于克魯維多孢酵母Kluyveromyces polysporus的羰基還原酶KpADH對CPMK具有最高的催化活性和對映選擇性，且該酶可用異丙醇為輔底物實現(xiàn)自身底物偶聯(lián)型輔因子循環(huán)。為了更好的應(yīng)用KpADH，作者對重組KpADH進(jìn)行純化，研究了該酶的最適溫度、最適pH、金屬離子依賴性、有機(jī)溶劑耐受性、底物特異性和酶動力學(xué)參數(shù)等酶學(xué)性質(zhì)，并考察了重組菌在生物催化CPMK不對稱還原上的效果，對進(jìn)一步利用雙芳基酮還原酶KpADH合成手性雙芳基仲醇具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 本研究所用到的菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用到的菌株及載體Table 1 Lists of microorganism strains and vectors used in the study

1.1.2 引物 本研究用到的引物見表2。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物5；胰蛋白胨10，氯化鈉10；pH 7.0，121℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基則添加2 g/dL的瓊脂。

表2 基因挖掘?qū)嶒炈靡颰able 2 Primers used in genome mining.

1.1.4 試劑 T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeI、BamH I、prime star DNA 聚 合 酶 、protein molecular marker：購于大連寶生物；2×Taq DNA 聚合酶：購于杭州寶賽生物工程有限公司；DNA marker、質(zhì)粒及基因組提取試劑盒、膠回收及PCR產(chǎn)物純化試劑盒：購于上海捷瑞生物工程有限公司；NADPH及NADP+：購于Roche；發(fā)酵培養(yǎng)基各種成分：購自國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；IPTG、卡那霉素：購于生工生物（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因序列的擴(kuò)增 按照酵母及細(xì)菌基因組DNA抽取試劑盒（上海生工生物有限公司）說明書提取各菌株的基因組，并以此為模板，添加表1所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：dNTP mix 4 μL，5× prime star buffer 10 μL，引物 1（10 μmol/L）1 μL， 引物 2 （10 μmol/L） 1 μL， 模板 10～50 ng，DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足到 50 μL。 PCR的擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min 10 s，循環(huán)25次，72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建 目的基因與表達(dá)載體pET-28a同時進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：目的基因/質(zhì)粒1 000 ng，10×K buffer 10 μL，Nde I（10 U/L） 2 μL，BamHI（10 U/L）2 μL，ddH2O 補(bǔ)足到 100 μL。 將上述反應(yīng)液混合均勻，于37°C酶切完全。參照核酸膠回收試劑盒說明書回收酶切后的目的基因和pET28a，然后用T4連接酶連接，連接體系為：T4連接酶 （5 U/L）1 μL，10×Ligation buffer 1 μL，線性化 pET28a 50 ng，目的基因 100 ng，ddH2O補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)液混合均勻，16℃連接10 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coli BL21（DE3）中，將后培養(yǎng)液均勻涂布于含有卡那霉素的固體平板上，于37℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗證，選擇陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)及測序驗證。

1.2.3 培養(yǎng)條件、粗酶液的制備、蛋白質(zhì)純化及酶活測定 將上述菌種接種至30 mL培養(yǎng)基中，于37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)，待OD600達(dá)0.6時加入30 μL IPTG誘導(dǎo)（IPTG濃度為100 mmol/L），于 30℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5 h。在4℃和8 000 g條件下離心5 min，倒掉上清液，向菌體中加入10 mL的磷酸鉀緩沖液（100 mmol/L，pH 7.0），使用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞（功率 285 W，工作 1 s，間歇 3 s，10 min）。 取其中1 mL進(jìn)行12 000 r/min離心5 min，取上清液（粗酶液）進(jìn)行酶活測定。重組KpADH蛋白的純化方法參見前期報道[10-11]。

還原活力測定方法：總反應(yīng)體系為200μL，包括 0.5 mmol/L NAD（P）H，0.5 mmol/L CPMK，磷酸鉀緩沖液（KPB，100 mmol/L，pH 5.5），充分混勻，30 ℃保溫2 min，加入10 μL合適濃度的酶液，檢測340 nm下吸收值的變化。酶活力單位（U）定義為：在上述條件下，每分鐘催化氧化 1 μmol NAD（P）H 所需要的酶量。

氧化活力測定方法：總反應(yīng)體系為200μL，包括 5 mmol/L NAD（P）+，10 mmol/L 異丙醇，磷酸鉀緩沖液（KPB，100 mmol/L，pH 10.0），充分混勻，30 ℃保溫2 min，加入10 μL合適濃度的酶液，檢測340 nm下吸收值的變化。酶活力單位（U）定義為：在上述條件下，每分鐘催化還原 1 μmol NAD（P）+所需要的酶量。

其中，EW為1 min內(nèi)340 nm處吸光值的變化；V為反應(yīng)液的總體積 （mL）；6 220為摩爾消光系數(shù)（L／（mol·cm））；l為光程距離（cm）。

蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法，以小牛血清白蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)品[12]。

酶比活力計算公式：

1.2.4 全細(xì)胞水相催化及檢測 將30 mL誘導(dǎo)后的重組菌E.coli BL21/pET28a-kpadh（OD600約為5），充分重懸于 9.5 mL磷酸鈉緩沖液 PBS（100 mmol/L，pH 8.0），于 20 mL的反應(yīng)器中加入 100 mmol/L 的 NADP+10 μL，500 mmol/L 的 CPMK （溶解于異丙醇）500 μL，總體系為10 mL。將上述反應(yīng)體系置于30℃，180 r/min振蕩反應(yīng)直至反應(yīng)結(jié)束。每隔一段時間取樣 100 μL， 加入 400 μL PBS（100 mmol/L，pH 8.0）緩沖液和 500 μL 乙酸乙酯萃取，取出上層有機(jī)相，待有機(jī)相自然揮發(fā)完全，加入500 μL HPLC級的乙醇，進(jìn)行正相HPLC檢測。

通過正相HPLC分析CPMK轉(zhuǎn)化率和 （R）-CPMA的對映選擇性，具體方法為：Agilent 1100 HPLC（美國），Chiralcel OB-H（0.46 mm×250 mm×5 μm）色譜柱，流動相為含有0.1%乙醇胺的正己烷∶乙醇（體積比 95∶5），流速 1.0 mL/min，254 nm，柱溫30 ℃，（S）-和 （R）-CPMA 的保留時間分別為 8.2、9.0 min。ee值計算公式：

式中，AR為（R）-CPMA 的峰面積；AS為（S）-CPMA的峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因挖掘、重組菌株的構(gòu)建及篩選

來源于近平滑假絲酵母 （Candida parapsilosis）的醇脫氫酶CpSADH，具有廣泛的底物譜，可以催化多種潛手性羰基化合物的不對稱還原，可還原76.6 g/L 的 1，3-丁二酮為（R）-1，3 丁二醇（95%ee）[13-14]，對苯乙酮、丁酮和酮酯等底物也有很高的還原活力，因此我們推測其底物結(jié)構(gòu)口袋較大，可以容納雙芳基酮類底物。更重要的是CpSADH具有底物偶聯(lián)輔因子再生的活性，可利用異丙醇為輔底物實現(xiàn)NADPH的原位再生[14]。具備底物偶聯(lián)的輔因子再生的羰基還原酶可單獨實現(xiàn)不對稱還原反應(yīng)的進(jìn)行和輔因子再生，無需外源輔因子再生系統(tǒng)如葡萄糖脫氫酶等的協(xié)助，避免了雙酶的比例不匹配等不足，降低催化劑的制備成本，受到生物還原法的青睞。在酶的基因挖掘中，序列相似性在30%～70%的基因通常既保留了一部分與探針酶相似的功能，又具有一定的特異性。因此本研究選用CpSADH作為基因挖掘的探針酶，將其蛋白質(zhì)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對后選取9個未經(jīng)報道且與探針序列相似性為34%～65%的基因進(jìn)行表達(dá)和篩選，見表3。

按照方法1.2.1和1.2.2成功將9個基因從基因組上進(jìn)行擴(kuò)增，并連接到表達(dá)載體pET28a，將重組載體熱轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3），成功構(gòu)建重組菌。按照方法1.2.3對重組菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)酶，并結(jié)合SDS-PAGE分析和酶活力分析對假定羰基還原酶進(jìn)行功能篩選。僅有來源于K.polysporus的CR1可以檢測到對CPMK有明顯的還原活力（1.4 U/mg），并且CR1還可氧化異丙醇 （0.40 U/mg）。因此CR1是一個具有底物偶聯(lián)輔因子再生能力的雙芳基酮還原酶，并將其命名為KpADH，其編碼基因為kpadh。為了進(jìn)一步拓展其在手性雙芳基醇合成中的應(yīng)用，作者對其進(jìn)行分離純化，研究了KpADH的酶學(xué)性質(zhì)及不對稱還原反應(yīng)效果。

2.2 KpADH的蛋白質(zhì)序列分析

羰基還原酶的分類有很多，按催化功能及空間結(jié)構(gòu)的差異可以分為3大類：醛還原酶（AKR）、短鏈脫氫酶（SDR）及中鏈醇脫氫酶[15]。SDR是氧化還原酶中具有多樣性功能的一類酶，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中一般包含保守N端、參與NAD（P）（H）識別和結(jié)合的Rossmann折疊、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非保守的C端。Extended SDR和Classical SDR是SDRs家族中最重要的兩個亞家族，Extended SDRs家族的酶有共同的輔因子結(jié)合區(qū)域及結(jié)合序列，即位于N端的[S/T]GXXGXX[G/A]（X代表任意的一種氨基酸）序列，除此之外還有保守的催化基序YXXXK。將KpADH的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對顯示，KpADH屬于Extended SDR亞家族。從數(shù)據(jù)庫中選取了KpADH的同源酶，并進(jìn)行多序列比對，結(jié)果見圖1。可以看出，KpADH雖然與這些酶在一級序列上具有一定的差異性，但二級結(jié)構(gòu)很保守，且具有保守的輔因子識別區(qū)和催化三聯(lián)體，如Ser126，Tyr165和Lys169（紅色三角形標(biāo)識）。綜上，KpADH與已知醇脫氫酶CpSADH的序列一致性僅為38%，且未曾有關(guān)于該酶催化功能的研究報道，該酶屬于短鏈脫氫酶家族的新成員。

表3 基因數(shù)據(jù)挖掘中所選取的假定羰基還原酶Table 3 Putative carbonyl reductases selected from NCBI database using genome mining

圖1 KpADH與來源于Extended SDRs家族蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對Fig.1 Sequence alignment of KpADH to other carbonyl reductase sequences

2.3 KpADH的純化

為了研究KpADH的酶學(xué)性質(zhì)，對重組KpADH依次進(jìn)行鎳柱純化、脫鹽和濃縮處理，最終得到0.5 mg/mL的純酶。對粗酶、穿透峰蛋白和純酶進(jìn)行SDS-PAGE分析，見圖2。KpADH純酶僅有一條帶，純酶純度達(dá)到電泳純，活力回收率約為45.5%。根據(jù)SDS-PAGE圖計算可知，KpADH單亞基的相對分子質(zhì)量約為45 000，與理論相對分子質(zhì)量大小相符。純酶的比還原活力8.9 U/mg，粗酶的比還原活力為1.4 U/mg，純化倍數(shù)為6倍。輔因子依賴性測定顯示，KpADH既可以依賴于NADPH也可依賴于NADH，且在NADPH存在下KpADH的活力約為NADH的5倍。

圖2 純化KpADH的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified KpADH

2.4 KpADH的動力學(xué)參數(shù)的測定

Km是酶的一個特征性常數(shù)，Km的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)，Km越小親和力越大，kcat越大催化效率越高，為了研究該酶對底物的親和力和催化效率，作者測定KpADH在不同底物濃度和輔酶濃度情況下的酶活，并得到了很好的線性擬合，見圖3。計算得到KpADH的動力學(xué)參數(shù)，見表4。

由表4可知，該酶對CPMK的親和力（Km=0.50 mmol/L）高于對異丙醇的親和力（Km=6.36 mmol/L），且還原CPMK的速率（kcat=64.67 s-1）高于氧化異丙醇的速率（kcat=55.27 s-1），因此KpADH對CPMK的底物專一性常數(shù) kcat/Km（129.33 L/（s·mmol））高于異丙醇（8.69 L/（s·mmol））。 由此可知該酶更傾向于發(fā)揮還原CPMK的功能，有利于還原反應(yīng)朝 （R）-CPMA合成的方向進(jìn)行。該酶對輔酶NADPH的kcat，kcat/Km均高于NADP+，說明該酶更傾向于氧化NADPH，這也符合該酶傾向于還原CPMK的結(jié)果。

圖3 KpADH的動力學(xué)參數(shù)Fig.3 Kinetic parameters of KpADH

表4 KpADH的動力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of purified KpADH

2.5 pH對KpADH催化活性的影響

緩沖液的pH會通過改變活性中心的微環(huán)境來影響酶的催化活性，本研究測定在不同的pH緩沖液中（檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.0～6.0）、磷酸鈉緩沖液（pH 6.0～8.0）、 甘氨酸-NaOH 緩沖液 （pH 8.0～12.0））KpADH的氧化和還原活力的高低，結(jié)果見圖4。對于KpADH的還原活力，其最適pH 5.5，當(dāng)pH＜5.5時活力迅速下降，當(dāng)pH＞5.5時下降緩慢，且在堿性范圍內(nèi)KpADH仍保留有一定的催化活力，如在pH 8.0時，相對活力約為58%。對于KpADH的氧化活力，其最適pH為9.5，當(dāng)pH＜9.5時，活力迅速下降，在酸性范圍內(nèi)僅保留有約40%的催化活力，在pH 9.5～11.0時，KpADH的相對氧化活力＞80%。此外，在氧化反應(yīng)的最適pH下，還原活力僅27%，而在還原反應(yīng)的最適pH下，氧化活力僅5%。為了利用該酶的底物偶聯(lián)輔因子再生的優(yōu)勢，需要同時具備較高的氧化和還原活力，才能實現(xiàn)輔因子原位再生和底物還原的目標(biāo)。因此在生物催化過程中，需要對反應(yīng)緩沖液的pH值進(jìn)行優(yōu)化，選擇氧化和還原活力均較高的pH，以使得催化劑發(fā)揮最大的作用。

圖4 pH對KpADH酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of purified KpADH

2.6 金屬離子及添加劑對KpADH活力的影響

據(jù)報道，少數(shù)SDR家族的羰基還原酶具有金屬離子依賴性，如二價金屬離子Mg2+可通過作用于酶的活性中心或底物結(jié)合位點而影響酶的活力。作者考察了不同金屬離子對羰基還原酶KpADH活力的影響，以不添加金屬離子所測得的酶活力為對照（100%），結(jié)果見表5。沒有發(fā)現(xiàn)具有顯著激活KpADH的氧化和還原活力的金屬離子。Mg2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Li+等離子對 KpADH 的還原和氧化活力的有輕微的激活作用，相對還原和氧化活力分別約為 110%和 120%；Zn2+、Al3+、Cu2+、Ag2+、Fe2+等離子對KpADH的氧化和還原活力都具有嚴(yán)重的抑制作用，推測可能是因為 Zn2+、Al3+、Cu2+、Ag2+、Fe2+與參與催化的氨基酸殘基結(jié)合從而導(dǎo)致了酶的活力下降。EDTA的添加并沒有使酶活力降低，從另一方面說明KpADH不是金屬離子依賴性酶。蛋白質(zhì)變性劑SDS的添加導(dǎo)致酶解聚成單體，而單體僅保留有8%的相對活力，說明KpADH的活性依賴于多聚體。吐溫20、DTT、β-巰基乙醇的添加可在一定程度上促進(jìn)KpADH的氧化和還原活力。其中，吐溫20使酶活力增加最多，可能由于吐溫20作為分散劑增加了難溶底物CPMK在水中的溶解度，從而增大了酶與底物的接觸機(jī)率；另外DTT與β-巰基乙醇是還原劑，二者的添加可以防止二硫鍵之間的交聯(lián)，這可能是二者添加使得酶活力增大的原因。

表5 金屬離子及添加劑對KpADH的還原酶和氧化酶活力的影響Table 5 Effects of metal ions and additives on the reducing and oxidizing activities of KpADH

2.7 有機(jī)溶劑對KpADH活力的影響

生物催化反應(yīng)的底物大部分都是不溶于水或難溶于水的，在催化反應(yīng)中需要添加助溶劑，以增加酶與底物接觸的機(jī)會，降低傳質(zhì)阻力。生物催化反應(yīng)要求助溶劑具有較好的生物相容性、對酶的毒性小、對底物的溶解性高。因此考察了常用有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、異丙醇、四氫呋喃、丙酮對酶活力的影響，CPMK在這5種有機(jī)溶劑中的溶解度能達(dá)到500 mmol/L，而且甲醇、乙醇和異丙醇也可作為催化反應(yīng)的輔底物。由圖5（a）可知，對于KpADH的還原活力，在體積分?jǐn)?shù)0.5%的5種溶劑中，酶活力都明顯高于空白對照，而在體積分?jǐn)?shù)1%時，酶活力開始降低，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于3%時，酶活力快速降低。由此可見，低體積分?jǐn)?shù)的有機(jī)溶劑可以使CPMK更好的分散，從而可以促進(jìn)酶活力，而隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)逐漸增加到一定程度，其毒性逐漸增強(qiáng)，酶活力顯著降低。另外，在低體積分?jǐn)?shù)有機(jī)溶劑條件下，甲醇是很好的助溶劑，而在稍高的體積分?jǐn)?shù)（如3%）時乙醇則是最好的助溶劑。異丙醇可作為KpADH的輔底物，適量的異丙醇即可促進(jìn)底物溶解，提高KpADH的催化活力，異丙醇達(dá)20%時，KpADH仍保留30%的相對活力，可見KpADH具有良好的異丙醇耐受性。由圖5（a）可知，表觀上丙酮對KpADH沒有毒性，20%的丙酮存在下KpADH仍保留117%的相對活力，這是由于丙酮自身也可作為KpADH的底物而被還原，因此丙酮對KpADH的影響要從氧化活力的變化來判斷。

由圖5（b）可知，隨著乙醇、甲醇、四氫呋喃、丙酮的體積分?jǐn)?shù)增高，酶氧化活力急劇降低，由此可見有機(jī)溶劑對KpADH氧化功能的毒性大于還原功能，尤其是四氫呋喃，僅0.5%即可抑制90%的氧化活力。丙酮作為異丙醇氧化的產(chǎn)物，對KpADH活力的影響同樣非常顯著，當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)大于5%時，氧化活力降低至20%。綜上，異丙醇可以作為該生物還原反應(yīng)優(yōu)選的助溶劑和輔底物，然而其輔產(chǎn)物丙酮對酶活力存在一定的影響，移除高體積分?jǐn)?shù)的丙酮可以降低抑制作用，促進(jìn)生物還原反應(yīng)朝手性雙芳基醇合成的方向進(jìn)行。

圖5 有機(jī)溶劑對KpADH的還原和氧化活力的影響Fig.5 Effect of organic solvents on the reducing and oxidizingactivities of KpADH

2.8 KpADH的底物特異性

為了研究KpADH不對稱還原多種潛手性酮的能力，拓展KpADH的應(yīng)用范圍，對其底物特異性進(jìn)行考查。選取一系列不同酮類（芳基酮、雙芳基酮、酮酯和烷基二酮）和醇類底物，考察KpADH對這些底物的氧化和還原活力，結(jié)果見表6。對于芳基酮類底物，KpADH對CPMK和苯乙酮均表現(xiàn)出較高的還原活力（100%和56.4%），這類底物位阻大，在水中溶解度低，與羰基還原酶的天然底物性質(zhì)相差較大，對此類底物有高的催化活性的酶較少。對比二苯甲酮，芐基苯乙酮和3，4-二氯二苯甲酮發(fā)現(xiàn)，隨著空間位阻的進(jìn)一步增大，KpADH的催化活性逐漸降低。 對于 2，3-戊二酮、2，4-戊二酮、2，3-己二酮、3，4-己二酮和 2，5-己二酮等二酮類底物，KpADH更易于還原2，4-戊二酮（74.6%相對活力）。KpADH對酮酯類底物的活力較高，對2-氧-4-苯基丁酸乙酯和乙酰乙酸乙酯的還原活力可以達(dá)到CPMK的24倍左右。對于氧化反應(yīng)的底物特異性，除了2，3-丁二醇外，相對活力均小于10%。KpADH氧化2，3-丁二醇的活力是氧化異丙醇活力的3.6倍，表明2，3-丁二醇可作為用于輔因子再生的潛在輔底物。

表6 KpADH的底物特異性Table 6 Substrate specificity of KpADH towards various prochiral ketones

2.9 利用KpADH不對稱還原制備（R）-CPMA

由于KpADH的氧化和還原活力的最適pH有所差異，合適的反應(yīng)緩沖液對于KpADH催化的生物還原反應(yīng)非常重要。因此考察利用KpADH在不同pH（pH 7.0，8.0和9.0）條件下催化反應(yīng)的效果。反應(yīng)相同時間后，終止反應(yīng)，液相色譜分析發(fā)現(xiàn)KpADH在pH 8.0的緩沖液中轉(zhuǎn)化率最高（＞99%），此時KpADH的相對還原活力和氧化活力分別為初始活力的43%和72%。所以選擇pH 8.0的緩沖液研究重組菌全細(xì)胞催化還原CPMK。

進(jìn)一步研究KpADH在制備雙芳基甲醇中的效果。在10 mL反應(yīng)體系中，利用重組菌E.coli BL21/pET28a-kpadh全細(xì)胞對100 mmol/L的CPMK進(jìn)行不對稱還原，反應(yīng)進(jìn)程見圖6。在10 h內(nèi)，CPMK轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.8%，經(jīng)分離純化后產(chǎn)物（R）-CPMA的摩爾得率為88.7%，ee值為82%。據(jù)報道[16]，利用來源于Kluyveromyces marxianus的羰基還原酶KmCR催化還原50 mmol/L CPMK，反應(yīng)12 h后，轉(zhuǎn)化率不到20%，產(chǎn)物（R）-CPMA的ee值僅為23.4%；利用來源于畢赤酵母GS115的羰基還原酶PasCR催化還原一系列二芳香基甲酮類化合物（10 mmol/L），轉(zhuǎn)化率最高僅為90%，且ee值較低[17]。盡管雙芳基甲酮類底物的位阻較大，KpADH仍然表現(xiàn)出較高的催化活性，為手性催化合成（R）-CPMA奠定了重要基礎(chǔ)。

圖6 重組菌E.coli BL21/pET28a-kpadh水相中不對稱催化還原CPMK的反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig.6 Time course of asymmetric reduction of CPMK by E.coli BL21/pET28a-kpadh in aqueous system

3 結(jié) 語

采用基因組數(shù)據(jù)挖掘的策略，從Kluyveromyces polysporus中發(fā)現(xiàn)了具有還原雙芳基酮活力的醇脫氫酶KpADH基因，并成功地在大腸桿菌中實現(xiàn)可溶性表達(dá)。KpADH屬于短鏈脫氫酶家族，具有保守的催化三聯(lián)體和輔酶結(jié)合域。KpADH可利用異丙醇為輔底物，原位再生輔酶NADPH。底物特異性研究發(fā)現(xiàn)，KpADH對酮酯類底物和2，3-丁二醇有更高的活力，分別是對CPMK和異丙醇活力的24倍和3.6倍左右。動力學(xué)參數(shù)研究表明，該酶更適合發(fā)揮其還原功能。KpADH氧化活力的最適pH 9.5，還原活力的最適pH 5.5，全細(xì)胞催化反應(yīng)的最適pH 8.0。在水相中能夠不對稱催化還原100 mmol/L CPMK，轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.8%，摩爾得率為88.7%，產(chǎn)物（R）-CPMA的ee值達(dá)到82%，是迄今為止不對稱還原雙芳基酮類底物效果較出色的一種新酶。本研究對高效制備光學(xué)純CPMA具有一定的指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步利用其合成光學(xué)純手性雙芳基醇，我們正在開展KpADH立體選擇性的分子改造。

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