不同月齡階段陜北白絨山羊生精細(xì)胞發(fā)育規(guī)律研究

韓 聰,方 乾,李 浩, 胡 姍, 朱海鯨, 胡建宏*(.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 700; .榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 79000)

雄性動(dòng)物睪丸發(fā)育情況直接影響其性成熟早晚及精液品質(zhì)，從而決定雄性動(dòng)物繁殖性能。精子發(fā)生起始于精原干細(xì)胞(SSCs)的自我更新和分化，睪丸組織中各級(jí)生精細(xì)胞分布反映了睪丸組織發(fā)育程度，睪丸組織學(xué)分析可直接觀察睪丸結(jié)構(gòu)變化規(guī)律及生精細(xì)胞分布情況[1]。

陜北白絨山羊是我國(guó)經(jīng)過(guò)30年培育而成的優(yōu)秀絨山羊地方品種，絨肉兼用，主要分布在陜北地區(qū)，具有耐粗飼、耐寒冷、抗風(fēng)沙、適應(yīng)性較強(qiáng)等特性[2-3]。但由于品種育成后陜北白絨山羊處于自然發(fā)展?fàn)顟B(tài)，缺乏系統(tǒng)研究。睪丸組織HE染色后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)能辨別各級(jí)生精細(xì)胞，其中精原細(xì)胞呈圓形，核大，呈圓形或輕微卵圓形，胞質(zhì)較少，核內(nèi)常染色質(zhì)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，異染色質(zhì)極少[4]。Kimura等[5]發(fā)現(xiàn)，成年男性睪丸中初級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞和長(zhǎng)形精子細(xì)胞與支持細(xì)胞的比率隨年齡增大明顯下降，而精原細(xì)胞與支持細(xì)胞的比率無(wú)明顯變化。說(shuō)明在不同發(fā)育期，動(dòng)物睪丸中生精細(xì)胞分布有一定差異。張旭靜[6]研究發(fā)現(xiàn)，1.5歲牦牛曲細(xì)精管內(nèi)可見(jiàn)1～2層生精細(xì)胞，精原細(xì)胞及精母細(xì)胞數(shù)較少、多處于休止期，可見(jiàn)極少數(shù)精子，處在性成熟前期，曲細(xì)精管直徑達(dá)到119.54 μm，精原細(xì)胞數(shù)達(dá)到27.79，精母細(xì)胞數(shù)21.83。展微[7]研究報(bào)道，遼寧絨山羊自出生后睪丸內(nèi)精原細(xì)胞數(shù)量呈逐漸增加的趨勢(shì)，并在1月齡時(shí)可見(jiàn)初級(jí)精母細(xì)胞，2月齡時(shí)有次級(jí)精母細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，3月齡時(shí)有精子細(xì)胞和精子出現(xiàn)，6月齡時(shí)精子細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始減少而精子數(shù)量開(kāi)始增加。睪丸發(fā)育情況及不同發(fā)育期睪丸中SSCs濃度至關(guān)重要。Chiarini-Garcia等[8]研究認(rèn)為，睪丸是一個(gè)動(dòng)態(tài)的組織，其SSCs不斷增殖并分化成為成熟的精子，在各個(gè)發(fā)育階段都存在SSCs的增殖和分化。但在牛[9]、犬[10]和豬[11]睪丸移植研究中，年輕未達(dá)到性成熟的睪丸組織比新生的睪丸組織移植后生精效率更高。目前，大多數(shù)SSCs體外培養(yǎng)研究中，都選擇青春期前睪丸組織[12-13]，這主要是由于年輕睪丸組織中有更多未分化的SSCs。

目前，對(duì)各家畜睪丸組織結(jié)構(gòu)及發(fā)育規(guī)律都有報(bào)道，但陜北白絨山羊睪丸組織學(xué)及生精細(xì)胞發(fā)育的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)取不同發(fā)育階段睪丸作組織切片，并用蘇木精-伊紅染色，觀察曲細(xì)精管形態(tài)，統(tǒng)計(jì)曲細(xì)精管橫切面各生殖細(xì)胞數(shù)，分析不同發(fā)育階段陜北白絨山羊睪丸發(fā)育程度，為進(jìn)一步探討陜北白絨山羊的種質(zhì)特性，了解其睪丸發(fā)育規(guī)律，挖掘其發(fā)展?jié)摿Φ於ɡ碚摶A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物學(xué)材料

分別取1月齡、3月齡、6月齡、成年陜北白絨山羊睪丸組織，用4%多聚甲醛溶液固定備用。另取1月齡、3月齡、6月齡、成年陜北白絨山羊新鮮睪丸組織，于-80 ℃ 凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織切片制備 活體取不同生理階段陜北白絨山羊睪丸組織，4%多聚甲醛固定，于PBS溶液洗3次，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋。切片厚 5 μm (每連續(xù)三刀內(nèi)只取一張)，貼于載玻片上，37 ℃ 干燥備用。

1.2.2 HE染色 常規(guī)HE染色參照病理學(xué)技術(shù)[14]進(jìn)行。切片于二甲苯中脫蠟10 min (兩次)，經(jīng)梯度乙醇溶液逐級(jí)復(fù)水后，蘇木素染液染色 5 min ，蒸餾水沖洗，于1% 鹽酸酒精溶液中分化30 S，蒸餾水沖洗，用淡氨水返藍(lán)1 min ，蒸餾水沖洗，0.5% 伊紅染液中浸染2 min ，蒸餾水沖洗，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片。自然干燥，于顯微鏡下觀察照相。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 用RNAiso plus試劑分別從1月齡、3月齡、6月齡、成年陜北絨山羊睪丸組織提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，大連)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物設(shè)計(jì)如表1。內(nèi)參為GAPDH，每個(gè)檢測(cè)重復(fù)3次。定量PCR反應(yīng)體系如表2。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 組織切片于400倍顯微鏡下觀察，測(cè)量細(xì)精管直徑，計(jì)數(shù)曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞層數(shù)及各細(xì)胞數(shù)。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)50個(gè)曲細(xì)精管。結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(Mean ± S.D)表示。定量PCR內(nèi)參為GAPDH，每個(gè)檢測(cè)重復(fù)3次。本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件17.0進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 睪丸組織學(xué)觀察

對(duì)1月齡、3月齡、6月齡及成年陜北白絨山羊睪丸組織進(jìn)行組織學(xué)分析，1月齡陜北白絨山羊曲細(xì)精管管徑較小，內(nèi)有支持細(xì)胞，精原細(xì)胞及少數(shù)性原細(xì)胞(gonocytes)(圖1A)。其中性原細(xì)胞位于曲細(xì)精管內(nèi)側(cè)，體積較大，HE染色著色較淺，已有多數(shù)性原細(xì)胞分化為精原細(xì)胞并附著于基膜。3月齡時(shí)管徑明顯增大，不見(jiàn)性原細(xì)胞，均發(fā)育成精原細(xì)胞附著于曲細(xì)精管基膜，一般在相鄰的精原細(xì)胞之間有多個(gè)支持細(xì)胞(圖1B)。6月齡時(shí)管徑繼續(xù)增大，已經(jīng)有空腔形成，少數(shù)精原細(xì)胞和支持細(xì)胞附著于基膜，其內(nèi)側(cè)由大量精母細(xì)胞占據(jù)，曲細(xì)精管的中央存在許多圓形精子細(xì)胞和長(zhǎng)形精子細(xì)胞(圖1C)。成年羊曲細(xì)精管管徑較6月齡略有增大，生殖細(xì)胞排列與6月齡相同，與6月齡相比，成年陜北白絨山羊曲細(xì)精管中央有更多的長(zhǎng)形精子細(xì)胞(圖1D)。

表1 定量PCR引物表Table 1 Primer sequences of quantitative PCR

表2 定量PCR反應(yīng)體系Table 2 The reaction system of quantitative PCR

2.2 曲細(xì)精管發(fā)育規(guī)律

從表3知，1月齡、3月齡、6月齡絨山羊曲細(xì)精管直徑隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著增大(P<0.05)，成年羊比6月齡曲細(xì)精管略有增大，差異不顯著(P>0.05)。細(xì)胞層數(shù)隨年齡的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，其中3月齡、6月齡和成年羊差異顯著(P<0.05)，3月齡比1月齡略高(P>0.05)。與1月齡、6月齡、成年羊相比，3月齡曲細(xì)精管中精原細(xì)胞最為豐富，明顯高于其他月齡(P<0.05)。陜北白絨山羊曲細(xì)精管橫截面細(xì)胞總數(shù)隨年齡增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，其中6月齡和成年羊曲細(xì)精管橫截面細(xì)胞總數(shù)顯著高于1月齡和3月齡(P<0.05)。

圖1 陜北白絨山羊睪丸組織學(xué)觀察(HE，×400)A. 1月齡陜北白絨山羊睪丸組織；B. 3月齡陜北白絨山羊睪丸組織；C. 6月齡陜北白絨山羊睪丸組織；D. 成年陜北白絨山羊睪丸組織;SG. 精原細(xì)胞；PS. 初級(jí)精母細(xì)胞；SS. 次級(jí)精母細(xì)胞；RST. 圓形精子細(xì)胞；EST. 長(zhǎng)形精子Fig. 1 Histological observation of cashmere goat testis (HE ×400)A. cashmere goat testis in 1 month;B. cashmere goat testis in 3 months;C. cashmere goat testis in 6 months;D. cashmere goat testis in adulthood;SG. spermatogonium;PS. primary spermatocyte; SS. secondary spermatocyte;RST. round spermatid; EST, elongated spermatid

表3 不同階段陜北白絨山羊曲細(xì)精管形態(tài)學(xué)分析Table 3 The morphology of seminiferous tube analysis of Cashmere Goat in different stages

注：同行數(shù)據(jù)上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note:Values with different lowercase superscripts in the same row indicate significant difference(P<0.05),and the same lowercase superscripts indicate insignificant difference(P>0.05). The same below.

2.3 生精細(xì)胞發(fā)育規(guī)律

對(duì)四個(gè)階段陜北白絨山羊睪丸曲細(xì)精管橫切面各細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。性原細(xì)胞只見(jiàn)于1月齡睪丸；精原細(xì)胞存在于四個(gè)發(fā)育期，1月齡精原細(xì)胞數(shù)顯著低于其他組(P<0.05)，3月齡、6月齡及成年羊無(wú)明顯差異(P>0.05)；3月齡睪丸可見(jiàn)極少數(shù)初級(jí)精母細(xì)胞，其數(shù)量顯著低于6月齡和成年羊(P<0.05)，6月齡和成年羊無(wú)明顯差異(P>0.05)。次級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞及長(zhǎng)形精子只見(jiàn)于6月齡和成年羊睪丸，6月齡睪丸中長(zhǎng)形精子細(xì)胞數(shù)顯著低于成年羊(P<0.05)。此外，6月齡陜北白絨山羊與成年羊曲細(xì)精管橫切面上各細(xì)胞分布相近。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果見(jiàn)圖2。SSCs標(biāo)記基因(CD49f、PLZF、Thy1、ETV5、VASA)及多能性相關(guān)基因(Oct4、Nanog、Nanos2)，均在3月齡陜北白絨山羊睪丸組織中高表達(dá)。其中Thy1、VASA及PLZF在3月齡睪丸中表達(dá)量最高(P<0.05)，其次是6月齡和成年羊(P<0.05);在1月齡睪丸中表達(dá)量最低(P<0.05);6月齡和成年羊差異不顯著(P>0.05)。ETV5、Nanog及Nanos2在3月齡睪丸中表達(dá)量最高，顯著高于其他發(fā)育期(P<0.05),其次是6月齡(P<0.05);在1月齡和成年羊睪丸中表達(dá)量最低(P<0.05)，1月齡與成年羊差異不顯著(P>0.05)。另外，CyclinA在6月齡羊睪丸中表達(dá)量最高，顯著高于其他發(fā)育期(P<0.05)，其次是3月齡(P<0.05)，在1月齡和成年羊睪丸中表達(dá)量最低(P<0.05);1月齡和成年羊差異不顯著(P>0.05)。CD49f在1月齡和3月齡高表達(dá)，且顯著高于6月齡和成年羊(P>0.05)，其次是成年羊(P<0.05)，在6月齡睪丸中表達(dá)量最低(P<0.05)，1月齡和3月齡差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同發(fā)育期陜北白絨山羊生精細(xì)胞分布Table 4 The distribution of spermatogenic cells of Cashmere goat in different stages

圖2 多能性基因在不同階段陜北白絨山羊睪丸組織中的表達(dá)同一指標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Fig. 2 The expression of pluripotent genes in Cashmere goat testis at different stagesDifferent lowercase letters of the same index differ significantly (P<0.05).

3 討 論

睪丸內(nèi)生精細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程是研究雄性精子發(fā)生機(jī)制的重要基礎(chǔ)，組織學(xué)分析是研究睪丸及生精細(xì)胞發(fā)育的重要技術(shù)手段。睪丸是一個(gè)動(dòng)態(tài)的組織，其SSCs不斷增殖并分化成為成熟的精子，在各個(gè)發(fā)育階段都存在SSCs的增殖和分化[8]。本研究得到了相似的結(jié)果，四個(gè)發(fā)育期陜北白絨山羊睪丸都有不同類(lèi)型精原細(xì)胞(包括SSCs)存在，并且與1月齡、6月齡(性成熟)及成年羊相比，3月齡睪丸中精原細(xì)胞(包含SSCs)濃度最高，達(dá)到46.40%。生精細(xì)胞的發(fā)育包括精原細(xì)胞增殖分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂為精子細(xì)胞以及精子形成[15]，睪丸組織學(xué)觀察可以通過(guò)細(xì)胞形態(tài)分辨各級(jí)生精細(xì)胞并分析其分布規(guī)律。本研究中，1月齡睪丸中有支持細(xì)胞、精原細(xì)胞及少數(shù)性原細(xì)胞，已有多數(shù)性原細(xì)胞分化為精原細(xì)胞并附著于基膜。到3月齡時(shí)，睪丸中不見(jiàn)性原細(xì)胞，性原細(xì)胞均發(fā)育成精原細(xì)胞，精原細(xì)胞明顯增多，并可見(jiàn)極少數(shù)初級(jí)精母細(xì)胞。6月齡時(shí)可見(jiàn)精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞和少數(shù)長(zhǎng)形精子細(xì)胞從曲細(xì)精管基底膜向中央有序排列。這與Griswold[16]研究一致，哺乳動(dòng)物的生精過(guò)程表現(xiàn)出嚴(yán)格的周期性規(guī)律和同源群現(xiàn)象。成年羊生精細(xì)胞分布與6月齡相似，曲細(xì)精管中央有更多的長(zhǎng)形精子細(xì)胞。說(shuō)明6月齡陜北白絨山羊已經(jīng)達(dá)到性成熟。展微[7]研究報(bào)道，遼寧絨山羊在1月齡時(shí)就可見(jiàn)初級(jí)精母細(xì)胞，2月齡時(shí)就有次級(jí)精母細(xì)胞出現(xiàn)，3月齡可見(jiàn)各級(jí)生精細(xì)胞和精子，6月齡時(shí)有大量精子產(chǎn)生?？梢?jiàn)陜北白絨山羊生精細(xì)胞發(fā)育比遼寧絨山羊晚1～2個(gè)月，推測(cè)這可能是受母本遺傳影響。陜北白絨山羊是以遼寧絨山羊作為父本，陜北子午嶺黑山羊作為母本培育而來(lái)[17]，而子午嶺黑山羊體型較小，生長(zhǎng)較慢[18]。

曲細(xì)精管是睪丸的主要組成部分，內(nèi)壁襯有生精上皮，主要包含生精細(xì)胞和支持細(xì)胞，是精子發(fā)生的場(chǎng)所。曲細(xì)精管直徑能反應(yīng)睪丸發(fā)育程度及雄性動(dòng)物繁殖力，展微[7]研究報(bào)道了不同月齡遼寧絨山羊曲細(xì)精管直徑，1月齡羊35.54 μm，3月齡103.97 μm，6月齡178.63 μm。本研究得到相似的結(jié)果，陜北白絨山羊曲細(xì)精管隨年齡增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，與遼寧絨山羊相比，陜北白絨山羊曲細(xì)精管生長(zhǎng)較慢；展微[7]研究發(fā)現(xiàn)，遼寧絨山羊的公羔的性行為發(fā)育較早，各個(gè)性行為在3月齡時(shí)已全部出現(xiàn)及完善，說(shuō)明遼寧絨山羊的公羔初情期和性成熟時(shí)間較早。本研究中6月齡陜北白絨山羊睪丸曲細(xì)精管直徑及其總細(xì)胞數(shù)與成年羊無(wú)明顯差異，細(xì)胞層數(shù)達(dá)到7.7層，并在6月齡能產(chǎn)生大量精子?？梢?jiàn)陜北白絨山羊在6月齡前已達(dá)到性成熟，具有生育能力。在實(shí)際生產(chǎn)中，陜北絨山羊在成年前后達(dá)到體成熟才進(jìn)行配種工作。鄭亦輝等[19]研究認(rèn)為，4月齡湖羊附睪內(nèi)可見(jiàn)有大量成熟精子，且4月齡公羊可使母畜受胎。武和平等[20]研究發(fā)現(xiàn)，布爾山羊公羊平均在242.5日齡達(dá)到性成熟。除品種因素外，外界環(huán)境因子，如季節(jié)、氣溫、光照、飼養(yǎng)方式等也會(huì)影響睪丸及生精細(xì)胞發(fā)育[21]。

動(dòng)物組織越接近青春期，精原細(xì)胞的濃度最高[22]。本試驗(yàn)中，精原細(xì)胞在3月齡睪丸組織中濃度最高。SSCs相關(guān)標(biāo)記基因均在3月齡睪丸組織高表達(dá)，其中CD49f、ETV5、VASA、PLZF及Thy1被認(rèn)為是SSCs特異性標(biāo)記基因[23]，OCT4、Nanog及Nanos2被認(rèn)為是多能性相關(guān)基因，而ETV5在SSCs的自我更新中起重要調(diào)節(jié)作用[24-26]。細(xì)胞周期蛋白與有絲分裂、減數(shù)分裂密切相關(guān)，其中Cyclin A、Cyclin B、Cyclin H 等基因與精子發(fā)生密切相關(guān)。Cyclin A1 基因特異性表達(dá)于哺乳動(dòng)物睪丸組織生精細(xì)胞，且只有在第一次減數(shù)分裂前的精原細(xì)胞和第一次減數(shù)分裂過(guò)程中的初級(jí)精母細(xì)胞檢測(cè)到表達(dá)[27]。PCR結(jié)果顯示，Cyclin A基因在6月齡羊睪丸中高表達(dá)，這可能是由于6月齡羊睪丸中有更多的精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞。有研究認(rèn)為，睪丸中PLZF 只在SSCs和未分化的精原細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[28-29]。本研究結(jié)果顯示，PLZF在3月齡羊睪丸中表達(dá)量顯著高于其他階段，3月齡陜北白絨山羊睪丸中幾乎還沒(méi)有初級(jí)精母細(xì)胞，曲細(xì)精管中除了支持細(xì)胞外，大多是精原細(xì)胞(包含SSCs)，這與前人的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

與1月齡、6月齡和成年羊相比，3月齡陜北白絨山羊睪丸組織含有更加豐富的精原細(xì)胞(含精原干細(xì)胞)，且顯著高于其他組，選擇3月齡前后睪丸組織更有利于陜北白絨山羊精原干細(xì)胞的體外分離。6月齡陜北白絨山羊睪丸中有較多精子細(xì)胞，并且各生殖細(xì)胞數(shù)目與成年羊無(wú)明顯差異，已經(jīng)達(dá)到性成熟。

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