實驗室飼養(yǎng)和野外生存條件下東方田鼠腸道菌群的多樣性

馮潔，沈志敏，王勝昌，林金杏，柏熊，謝建云*

(1. 上海實驗動物研究中心，上海 201203； 2. 上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，上海 201203)

東方田鼠(Microtusfortis)在分類學上隸屬于嚙齒目、倉鼠科、田鼠亞科、田鼠屬，主要分布于我國西北、東北及南方的16個省區(qū)，在我國存在5個亞種。東方田鼠是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一具有天然抗血吸蟲病的哺乳動物，其中分布于長江中下游的長江亞種是血吸蟲病流行區(qū)洞庭湖湖區(qū)的優(yōu)勢鼠種，具有重要的應用價值[1,2]。20世紀90年代末，上海實驗動物研究中心和湖南湘雅醫(yī)學院開始對東方田鼠進行實驗室繁育。飼養(yǎng)的過程中研究人員發(fā)現(xiàn)，實驗室飼養(yǎng)條件下的東方田鼠易發(fā)生脂肪肝和卵巢癌，可誘發(fā)導致糖尿病等情況[3-5]。為探討不同生存模式下東方田鼠腸道菌群的分布和差異，本文首次采用基于細菌16S rDNA的高通量測序技術，對實驗室飼養(yǎng)和野外捕捉的東方田鼠腸道菌群多樣性進行比較分析，為充實東方田鼠基礎生物學數據積累資料，為東方田鼠資源的進一步開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗室飼養(yǎng)洞庭湖種群東方田鼠12只，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供【SCXK(滬)2013-0016】，8周齡，體重50～80 g，1998年捕獲于洞庭湖湖區(qū)飼養(yǎng)至今，飼養(yǎng)于屏障設施環(huán)境中，室內的溫度常年控制在(22±2)℃，相對濕度控制在40%～70%，人工采光，晝夜交替12 h∶12 h。飼料為大小鼠通用飼料，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司生產并提供，自由采食和飲水。野生洞庭湖種群東方田鼠20只，2016年12月捕獲于湖南洞庭湖區(qū)，成年，健康狀況良好，體重約40～70 g，捕獲現(xiàn)場采集腸道標本，置于干冰中帶至實驗室。

1.1.2 主要試劑和儀器

細菌基因組快速提取試劑盒購自Qiagen公司，DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，PCR擴增儀為ABI GeneAmp? 9700 型，測序儀為美國Illumina公司hiseq 2500型。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提

處死動物，用酒精消毒皮膚后解剖，暴露回盲部，取0.2 g回盲部內容物，懸浮于1 mL的PBS(pH7.4)中850 g離心5 min，取上清，制成細菌懸液用于DNA提取?；蚪MDNA抽提操作步驟參照試劑盒說明書。DNA抽提后經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

1.2.2 PCR擴增

設計引物接頭對細菌的16S rDNA-V4-V5區(qū)片段進行PCR擴增。將同一樣本的PCR產物混合后經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收產物后進行定量，按相應比例進行混合。

1.2.3 Illumina PE250文庫構建

連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集。經氫氧化鈉變性產生單鏈DNA片段。

1.2.4 高通量測序和生物信息學分析

高通量測序和生物信息學分析由上海凌恩生物科技有限公司完成。

測序流程如下：DNA片段一端與引物堿基互補，固定于芯片上，另一端隨機與附近的另外一條引物互補，也被固定形成“橋”。PCR擴增產生DNA簇，激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列所聚合上的核苷酸種類。統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號，即可獲知模板DNA片段序列。

對所有有效序列進行質控過濾，舍棄低質量序列。利用軟件將相似度大于0.97的序列歸為1個操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)，統(tǒng)計各樣品所含OTU的數量，去除無法分類的OTU后進行后續(xù)分析，繪制稀疏曲線。基于OTU聚類分析結果進行多樣性指數分析?；谌郝浣Y構分析，在門和屬兩個分類水平統(tǒng)計多樣品的物種分布和豐度差異。

2 結果

2.1 回盲部內容物細菌物種豐度分析

將序列按相似性進行OTU劃分，繪制稀疏曲線(圖1)。總體趨勢體現(xiàn)為：序列數<10 000時OTU數量隨著樣本序列數的增加而迅速增加，序列數在10 000～30 000之間時OTU數量緩慢增加，之后則趨于平臺期，表明取樣數量合理，測序充分。

通過樣本的多樣性分析可反映出微生物群落的豐度和多樣性，常用豐富度指數表示。在OTU水平，各樣本的OTU數目、豐富度指數(Chao)、覆蓋率指數(Coverage)及多樣性指數(Shannon、Simpson)見表1。Coverage值越高，代表樣本中序列被測出的概率越高。Shannon值越高，代表群落多樣性越高，而Simpson 指數值越大，說明群落多樣性越低。

圖1 各樣本的稀疏曲線Fig.1 Rarefaction curves of the samples

樣品SamplesOUT數目OTUnumberChaoChao樣品覆蓋率Coverage多樣性指數DiversityindexShannonindexesSimpsonindexes14685730.9951774.370.029426187230.9937365.060.012936386900.9969574.620.034646317090.9965425.190.011056937760.9964205.120.014164645650.9967624.810.016776157400.9967534.640.026387919040.9972465.050.015497538810.9966055.060.0145106677760.9961995.380.0082118068740.9981795.370.0104126427150.9981495.090.0161136747700.9972635.040.0146147258210.9971165.080.0159156036770.9974864.740.0282167618270.9981865.210.0127177087870.9981554.699.0251186547250.9980104.650.0325195917200.9955315.080.0104206507690.9977154.950.0153214334850.9984254.410.0234225136100.9974694.450.0256234424770.9985454.270.0403244865420.9987744.450.0243254204530.9986224.420.0231264454980.9987183.890.0636274514990.9986184.350.0333284405010.9983344.550.0215294685020.9989524.240.0383304574950.9985034.360.0296314234570.9980993.880.0637324084540.9982584.490.0228

2.2 細菌群落結構分析

將實驗室飼養(yǎng)和野外生存的動物樣本OTU在門和屬的水平進行歸類分析。如圖2所示，兩組樣本共有的OUT有455個，各自獨有的OTU個數分別是143和699。

注：紅色：實驗室飼養(yǎng)組;綠色：野外生存組。圖2 兩組樣本OTU歸類圖Note. Red: Laboratory feeding group. Green: Wild survival group.Fig.2 OTU classification of the two group samples

圖4 兩組樣本細菌在屬水平的分布Fig.4 Bacteria composition at genus level of the two groups of samples

在門水平，實驗室飼養(yǎng)樣本細菌隸屬12個門，其中厚壁菌門(Firmicutes)占58.43%、擬桿菌門(Bacteroidetes)占34.76%、螺旋菌門(Spirochaetae)占4.87%，其余9個門合計僅占1.95%。野外采集樣本細菌隸屬14個門，其中厚壁菌門(Firmicutes)占54.29%、擬桿菌門(Bacteroidetes)占41.56%、螺旋菌門(Spirochaetae)占2.15%，其余10個門合計僅占2.00%(圖3)。兩組樣本共有11個門重疊，實驗室飼養(yǎng)樣本有1個獨有的門，即黏膠球形菌門(Lentisphaerae)，野外生存樣本有3個獨有的門，分別是梭桿菌門(Fusobacteria)、奇古菌門(Thaumarchaeota)和未分類的門。在屬水平，兩組樣本共檢測到205個屬，實驗室飼養(yǎng)樣本細菌隸屬125個屬，野外生存樣本細菌隸屬192個屬。其中112個屬為兩者共有，13個屬為實驗組獨有，80個屬為野生組獨有(圖4)。

實驗室飼養(yǎng)組 野外生存組Laboratory feeding group Wild survival group圖3 兩組樣本細菌在門水平的分布Fig.3 Bacteria composition at phylum level of the two groups of samples

2.3 物種豐度差異性分析

根據分類學組成，對微生物類群進行組間比較分析(LEfSe)，即LDA分析(線性回歸分析)，并繪制進化分支圖以了解兩組樣本微生物物種的差異[6](圖5)。紅色區(qū)域和綠色區(qū)域分別表示實驗組和野生組，紅色節(jié)點表示在實驗組中起重要作用的微生物類群，綠色節(jié)點表示在野生組中起重要作用的微生物類群，黃色節(jié)點表示在兩組別中均未起到重要作用的微生物類群。當LDA值>2，P值<0.05時認為該物種為差異物種，差異組別為兩組中豐度高的一組。結果顯示，在門的水平，共有5個門存在差異(表2)；在屬的水平，共有64個屬存在差異，差異最大的為瘤胃球菌屬。因存在差異的屬較多，僅列出差異值前10的屬(表3)。

圖5 兩組樣本LEfSe分析進化分支圖Fig.5 Evolutionary branch cladogram of LEfSe analysis of the two groups of samples

門Phylum豐度Abundance差異組別DifferentialgroupLDA值LDAvalueP值PvalueBacteria.Tenericutes軟壁菌門0.0091YSC3.390.047Bacteria.Elusimicrobia迷蹤菌門0.0017SYC2.940.0036Bacteria.Deferribacteres脫鐵桿菌門0.0015YSC2.840.045Bacteria.Lentisphaerae黏膠球形菌門0.00023SYC2.690.000001Bacteria.Verrucomicrobia疣微菌門0.0004SYC2.650.00063

表3 兩組樣本在屬水平的豐度差異分析Tab.3 Differential analysis of genus abundanceof the two groups of samples

3 討論

隨著近年來對腸道菌群研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)腸道微生物對宿主健康起重要作用。臨床上許多重要疾病的發(fā)生、發(fā)展都與腸道微生物的組成以及數量的增減有密切的關系。結構異常的腸道菌群很可能是肥胖、高血壓、糖尿病等慢性病的直接誘因。研究表明，動物消化道中存在著種類繁多、數量龐大的微生物，它們是宿主機體重要的組成部分，參與腸道發(fā)育、營養(yǎng)吸收、能量代謝、免疫應答等生理活動[7-9]。腸道菌群組成的影響因素眾多，主要包括宿主自身的因素和外部環(huán)境的影響。16S rDNA基因存在于所有細菌的基因組中，具有高度的保守性和特異性，并且該基因序列足夠長(包含約50個功能域)。隨著PCR技術的出現(xiàn)及核酸研究技術的不斷完善，16S rDNA基因檢測技術已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具[10-11]。

本研究通過對洞庭湖種群東方田鼠腸道樣本的細菌16S rDNA V4-V5可變區(qū)序列進行擴增，并利用高通量測序技術和序列比對，對實驗室飼養(yǎng)和野外生存的東方田鼠腸道菌群的分布特點和差異進行分析。兩組樣本的稀疏曲線表明取樣合理，高通量測序深度充分。在門水平比較發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的分布和占比基本相似，豐度最高的為厚壁菌門，其次為擬桿菌門，這兩類微生物對于機體健康有深遠的影響，在纖維物質消化和脂肪沉積中起主要作用。豐度差異上比較發(fā)現(xiàn)，野外的東方田鼠軟壁菌門、脫鐵桿菌門的豐度較實驗組高。在屬水平上，野生的東方田鼠腸道細菌較實驗室飼養(yǎng)的豐富。兩組動物差異顯著的菌群主要為參與消化道能量代謝和吸收的細菌，如瘤胃球菌與纖維素的附著程度和消化率有重要關聯(lián)，普雷沃菌是一種纖維降解菌，能產生木聚糖酶，擬桿菌在分解多糖提高營養(yǎng)利用率、加快腸黏膜的血管形成、維持腸道微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用。研究表明，普雷沃菌和擬桿菌可驅動胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良，引起糖尿病、高血壓等疾病[12]。而嗜膽菌屬在健康機體腸道中豐度極低，動物性食物、脂肪含量高的飲食可增加膽汁的產生，進而導致嗜膽菌屬的增加。非酒精性脂肪肝引起的代謝綜合征也有類似情況出現(xiàn)。上述發(fā)現(xiàn)為進一步探討實驗室飼養(yǎng)東方田鼠易發(fā)脂肪肝、糖尿病的機制提供了一個思路。

通過對食草動物、食肉動物和雜食動物的腸道菌群組成比較發(fā)現(xiàn)，食草動物為了消化復雜的含纖維素食物，腸道菌群多樣性程度遠高于雜食和食肉動物，說明在宿主和腸道菌群協(xié)同進化過程中，飲食結構對菌群結構影響非常明顯[13]。東方田鼠是以取食植物綠色部分為主的草食性嚙齒動物，野外生存時植物莖、葉在東方田鼠的食物組成中占絕對優(yōu)勢[14]。實驗室條件下人工喂養(yǎng)的鼠飼料營養(yǎng)成分雖參照動物的生理特性進行制作，但與野生鼠覓食的情況仍有差異，且動物活動受限，能量需求較野生鼠也發(fā)生變化。我們推測，為了適應不同的環(huán)境，動物的生物學特性及代謝規(guī)律形成各自的規(guī)律和特點，這也是導致腸道菌群差異的主要原因。

本文對東方田鼠腸道菌群進行分析研究，發(fā)現(xiàn)不同的生活環(huán)境、飲食結構會對機體腸道微生物的組成產生影響，研究數據進一步充實了東方田鼠基礎生物學數據，也為東方田鼠在比較醫(yī)學及腸道微生態(tài)領域的研究開發(fā)提供參考。

(致謝：感謝中國科學院亞熱帶生態(tài)研究所王勇研究員、李波研究員、張美文研究員以及張琛同學在東方田鼠采樣過程中提供的幫助！)

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