收獲期霉變與正常燕麥籽粒表面菌群差異分析

劉龍龍，馬名川，張麗君，崔 林，韓淵懷,2，周建萍

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801)

作物收獲期出現(xiàn)連陰雨時(shí)，田間透氣性差、濕度大，成熟的籽粒為田間微生物生長(zhǎng)提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，若這一時(shí)期溫濕度適宜，田間微生物會(huì)迅速繁殖，導(dǎo)致作物籽粒霉變[1-2]，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[3-4]。由于我國(guó)燕麥主產(chǎn)區(qū)獨(dú)特的氣候條件，燕麥成熟期處于多雨季節(jié)，常常由于陰雨天氣而無(wú)法及時(shí)收獲，加之我國(guó)種植的主要為裸燕麥，籽粒表面有一層絨毛，在收獲期和儲(chǔ)存過(guò)程中易受微生物感染而出現(xiàn)霉變[5]。燕麥霉變會(huì)影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，霉菌產(chǎn)生的毒素可通過(guò)食物鏈對(duì)人體和動(dòng)物健康產(chǎn)生危害[6]。了解引起燕麥籽粒霉變的主要菌群對(duì)燕麥安全生產(chǎn)具有重要意義。

用傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法從環(huán)境中分離出的微生物僅占總量的 1%～10%[7]，無(wú)法完整地解析樣品中微生物的組成和豐富度，對(duì)確定導(dǎo)致作物霉變的特異性菌種帶來(lái)一定困難。分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展使完整分析環(huán)境中微生物菌群的結(jié)構(gòu)成為可能。宏基因組學(xué)學(xué)科的發(fā)展，克服了普通分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的局限性，使低豐富度物種能被正確檢測(cè)出來(lái)，海量的數(shù)據(jù)也使得物種的分類更加準(zhǔn)確[8-9]。

目前，關(guān)于燕麥?zhǔn)斋@期連陰雨造成籽粒田間霉變的研究報(bào)道較少，對(duì)引起燕麥?zhǔn)斋@期籽粒霉變的主要菌群尚不清楚。本試驗(yàn)選取收獲期正常和霉變的品燕2號(hào)籽粒，通過(guò)表面菌群的宏基因組檢測(cè)，比較正常和霉變燕麥籽粒表面菌群和豐度差異，以期確定引起收獲期燕麥籽粒霉變的主要菌群，為燕麥霉變的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試燕麥品種為品燕2號(hào)。2015年9月分別在岢嵐縣神堂坪鄉(xiāng)黑峪村(籽粒正常)和高家會(huì)鄉(xiāng)西會(huì)村(籽粒霉變)收獲燕麥籽粒(圖1)，每個(gè)地點(diǎn)重復(fù)取樣三次，每次取樣500 g，取樣后迅速放入4 ℃冰箱保存。

圖1 正常籽粒(左)與霉變籽粒(右)

1.2 方 法

1.2.1 總DNA的提取和測(cè)定

取樣品10 g，用PBS緩沖液沖洗燕麥籽粒表面三次，收集籽粒表面菌體，12 000 r·min-1離心30 s，棄上清后，采用天根糞便基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行總DNA提取。采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)。采用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 樣品的完整性。

1.2.2 宏基因組測(cè)序

細(xì)菌宏基因組16S V4 區(qū)和真菌宏基因組ITS 區(qū)的擴(kuò)增及測(cè)序由上海派森諾生物科技有限公司完成。細(xì)菌和真菌多樣性的測(cè)定參考Caporaso等[10]的方法。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量過(guò)濾后利用Flash對(duì)通過(guò)質(zhì)量過(guò)濾的序列進(jìn)行連接，最后根據(jù) index 信息提取每個(gè)樣品的有效序列；運(yùn)用 Qiime[11](version 1.7.0，http://qiime.org/)進(jìn)行序列過(guò)濾，運(yùn)用 mothur[12](version 1.31.2，http://www.mothur.org/)軟件中 uchime[13]的方法去除嵌合體序列，得到最終用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。在 Qiime 中調(diào)用 uclust[14]的方法對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按相似度 0.97 進(jìn)行聚類，選取每個(gè)類最長(zhǎng)的序列為代表序列，在 Qiime 中采用 blast[15]的方法對(duì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè) OTU 分類學(xué)信息，并對(duì) OTU 的代表序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用 mothur 軟件生成樣本間OTU 的維恩圖。對(duì)每個(gè)樣品的 OTU 按照豐度從大到小排序，對(duì)各個(gè)豐度值取 log2 作為縱坐標(biāo)，OTU的序數(shù)作為橫坐標(biāo)，做豐度分布曲線圖。根據(jù) OTU 列表中的各樣品物種豐度情況，應(yīng)用軟件 mothur 中的 summary.single 命令，計(jì)算 4 種常用的生物多樣性指數(shù)。對(duì) OTU 表利用 Qiime 生成不同分類水平上(門、綱、目、科、屬、種)的物種豐度表和分布圖。應(yīng)用軟件 mothur 中的 metastats(http://metastats.cbcb.umd.edu/)命令進(jìn)行差異顯著性分析。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常籽粒與霉變籽粒表面微生物多樣性分析

用維恩圖中OTUs重疊數(shù)多少說(shuō)明正常籽粒與霉變籽粒微生物多樣性相關(guān)程度(圖2)，正常籽粒與霉變籽粒中細(xì)菌OTUs總數(shù)分別為1 063和2 040，兩個(gè)樣品獨(dú)有的OTUs分別為494和1 471，占各自O(shè)TUs總數(shù)的46.47%和72.11%；正常籽粒與霉變籽粒中真菌OTUs總數(shù)分別為98和112，兩個(gè)樣品獨(dú)有的OTUs分別50和64，占各自O(shè)TUs總數(shù)的51.20%和57.14%。結(jié)果表明，籽粒表面細(xì)菌的OTUs數(shù)比真菌的高；霉變籽粒表面真菌OTUs數(shù)的組成相似度比細(xì)菌高；霉變籽粒中細(xì)菌物種的差異程度比真菌大。

為了比較正常籽粒與霉變籽粒細(xì)菌、真菌群落在物種豐度和均勻度上的差異, 進(jìn)行了細(xì)菌和真菌的Rank-abundance分析(圖3)。霉變籽粒細(xì)菌和真菌OTUs數(shù)目均大于正常籽粒，說(shuō)明霉變籽粒細(xì)菌和真菌物種豐度均高于正常籽粒，其中，細(xì)菌的物種豐度差異更為明顯，兩個(gè)樣品中細(xì)菌和真菌物種均勻度(曲線形狀)較相近。

由表1可知，正常籽粒與霉變籽粒細(xì)菌群落多樣性均高于真菌，霉變籽粒的物種多樣性高于正常籽粒。

圖2 正常籽粒與霉變籽粒微生物OTUs維恩圖(左：細(xì)菌，右：真菌)

2.2 正常籽粒與霉變籽粒表面菌群組成分析

從門的分類水平看，兩個(gè)樣品中已確定的表面真菌主要隸屬于2個(gè)門，正常籽粒的中子囊菌門(Ascomycota)真菌占44.3%，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)占3.4%；霉變籽粒的中子囊菌門(Ascomycota)占76%，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)占0.9%。兩個(gè)樣品中均有未確定分類的真菌，正常籽粒未確定真菌(unidentified)占52.3%，霉變籽粒中unidentified占23.1%(圖4A、B)。正常籽粒表面共檢出細(xì)菌37個(gè)門，優(yōu)勢(shì)菌群隸屬于變形菌門(Proteobacteria，60%)、藍(lán)菌門(Cyanobacteria，30%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，3.94%)、放線菌門(Actinobacteria，2.51%)、厚壁菌門(Firmicutes，1.34%)(圖4C)；霉變籽粒表面共檢出細(xì)菌31個(gè)門，優(yōu)勢(shì)菌群隸屬于變形菌門(Proteobacteria，75%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，8.43%)、放線菌門(Actinobacteria，6.76%)、藍(lán)菌門(Cyanobacteria，4.80%)、厚壁菌門(Firmicutes，1.34%)(圖4D)。正常籽粒和霉變籽粒中，細(xì)菌和真菌在門水平的組成比例存在明顯差異。就細(xì)菌而言，兩個(gè)樣品中占比最大的都是變形菌門，但在霉變籽粒中的占比明顯高于正常籽粒；正常籽粒中藍(lán)菌門的占比明顯高于霉變籽粒，而霉變籽粒中擬桿菌門和放線菌門明顯高于正常籽粒。就真菌來(lái)說(shuō)，正常籽粒中擔(dān)子菌門和未確定分類地位的真菌比例顯著高于霉變籽粒，而霉變籽粒中子囊菌門的占比顯著高于正常籽粒。

圖3 正常籽粒與霉變籽粒表面真菌(A)和細(xì)菌(B)豐度分布曲線

樣品Sample微生物MicroorganismChao指數(shù)ChaoindexAce指數(shù)AceindexSimpson指數(shù)SimpsonindexShannon指數(shù)Shanonindex正常籽粒Normaloatgrain細(xì)菌Bacteria127812850.3462.080真菌Fungus1231370.2841.796霉變籽粒Mouldyoatgrain細(xì)菌Bacteria239230780.0843.565真菌Fungus1632100.2491.835

從屬的分類水平來(lái)看，正常籽粒表面共檢出真菌43個(gè)屬，其中，已確定分類地位的優(yōu)勢(shì)真菌隸屬于核腔菌屬(Pyrenophora，21.7%)、鏈格孢屬(Alternaria，7.6%)、Radulidium(7.4%)、Davidiella(3.9%)、赤霉菌屬(Gibberella，1.24%)、隱球菌屬(Cryptococcus，1.1%)、非優(yōu)勢(shì)菌總和(others)占4.76%(圖4E)；霉變籽粒表面共檢出真菌43個(gè)屬，其中，已確定分類地位的優(yōu)勢(shì)菌隸屬于鏈格孢屬(Alternaria，38.7%)、核腔菌屬(Pyrenophora，25.2%)、赤霉菌屬(Gibberella，7.2%)、Davidiella(2.39%)，非優(yōu)勢(shì)菌總和(others)占3.41%(圖4F)。分類未確定的真菌，正常籽粒占52.3%，霉變籽粒占23.1%。正常籽粒表面真菌中未確定分類的優(yōu)勢(shì)真菌豐度均高于霉變籽粒。正常籽粒表面共檢出細(xì)菌409個(gè)屬，已確定分類的優(yōu)勢(shì)菌隸屬于薄層菌屬(Hymenobacter，2.1%)、歐文氏菌屬(Erwinia，1.8%)、假單胞菌屬 (Pseudomonas，1.4%)，非優(yōu)勢(shì)菌(others)總和占12.7%(圖4G)；霉變籽粒表面共檢出細(xì)菌548個(gè)屬，已確定分類的優(yōu)勢(shì)菌隸屬于歐文氏菌屬(Erwinia，20%)、假單胞菌屬(Pseudomonas，15%)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella，6%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium，3.7%)、Ramlibacter(2.6%)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium，1.9%)、短小桿菌屬(Curtobacterium，1.6%)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus，1.6%)、土地桿菌屬(Pedobacter，1.3%)，非優(yōu)勢(shì)菌(others)總和為24.9%(圖4H)。屬水平兩者均有未確定分類的細(xì)菌，正常籽粒中，兩個(gè)優(yōu)勢(shì)菌分別屬于 α-變形桿菌的Alphaproteobacteria(52%)和藍(lán)藻門的Cvanobacteria(30%)；霉變籽粒中分別為Alphaproteobacteria(12%)、Cvanobacteria(4.8%)、黃單胞菌科Xanthomonadaceae(4.6%)。從屬的角度看，正常籽粒和霉變籽粒間細(xì)菌和真菌群落的組成比例有明顯差異。在正常籽粒中為優(yōu)勢(shì)菌群，而在霉變籽粒中不是優(yōu)勢(shì)菌群的有：薄層菌屬、Radulidium、隱球菌屬。在霉變籽粒中為優(yōu)勢(shì)菌株，而在正常籽粒中不是優(yōu)勢(shì)菌株的有克雷白氏桿菌屬、Xanthomonadaceae、金黃桿菌屬、Ramlibacter、農(nóng)桿菌屬、短小桿菌屬、類芽孢桿菌屬、土地桿菌屬。通過(guò)計(jì)算兩個(gè)樣品中屬水平上的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌的豐度倍數(shù)差異發(fā)現(xiàn)，除核腔菌屬外，兩樣品中的其他優(yōu)勢(shì)菌群差異均顯著(表2)。

表2 屬水平優(yōu)勢(shì)菌的差異性比較Table 2 Abundance differences of bacteria and fungus between normal oat grain and mouldy oat grain

倍數(shù)差異大于1或小于-1 則說(shuō)明樣品之間物種豐度差異顯著。

The number in the column of abundance differences between normal oat grain and mouldy oat grain, more than 1 or less than -1 indicates the difference in species abundance between samples is significantly different.

3 討 論

本研究中，霉變籽粒的菌群豐度和物種多樣性均高于正常籽粒。所采集樣品在收獲期均遭受連陰雨天氣，正常籽粒采集于高海拔山區(qū)，在收獲期夜間氣溫5～10 ℃，白天溫度15 ℃左右，山地不易積水，風(fēng)大，田間濕度相對(duì)較小，整體環(huán)境不利于菌群生長(zhǎng)；霉變籽粒采集于平地，收獲期夜間氣溫8～13 ℃，白天溫度15～25 ℃，同時(shí)平地易積水，田間濕度較大，整體環(huán)境有利于菌群生長(zhǎng)。這些氣候條件的差異可能是引起收獲期燕麥籽粒表面菌群多樣性和豐度差異的主要因素，為了避免收獲期燕麥籽粒發(fā)生霉變，建議燕麥種植在高海拔坡地。

本研究中，在屬水平細(xì)菌中，Pseudomonas、Erwinia在正常籽粒和霉變籽粒中的豐度差異顯著，在霉變籽粒的豐度值為1 539和1 975，在正常籽粒中僅為136和182；真菌中，Alternaria、Pyrenophora、Gibberella在正常籽粒和霉變籽粒中的豐度差異顯著，在霉變籽粒中豐度值分別達(dá)到5 810、3 781、1 085，在正常籽粒中豐度值分別為1 144、2 260、124。而未確定分類地位的優(yōu)勢(shì)真菌和細(xì)菌，在正常籽粒中高于霉變籽粒。燕麥籽粒霉變現(xiàn)象為表面變黑，以上已確定屬的菌中僅鏈格孢菌菌絲和孢子為黑色，推測(cè)Alternaria是引起收獲期燕麥籽粒霉變的主要原因。已有研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢菌廣泛分布于自然界中，對(duì)環(huán)境與寄主的適應(yīng)性很強(qiáng),是引起植物病害的一個(gè)重要真菌類群[16]；90%以上的鏈格孢菌可以兼性寄生在不同科的植物上,能夠引起包括小麥、玉米、油菜等幾十種農(nóng)作物的真菌性病害,造成經(jīng)濟(jì)損失[17-20]。

A：正常籽粒門水平上優(yōu)勢(shì)真菌菌群分布；B：霉變籽粒門水平上優(yōu)勢(shì)真菌菌群分布；C：正常籽粒門水平上優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群分布；D：霉變籽粒門水平上優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群分布；E：正常籽粒屬水平上優(yōu)勢(shì)真菌菌群分布；F：霉變籽粒屬水平上優(yōu)勢(shì)真菌菌群分布；G：正常籽粒屬水平上優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群分布；H：霉變籽粒屬水平上優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群分布。

a:Normal oat grain phyla fungus; B:Mouldy oat grain phyla fungus; C:Normal oat grain phyla bacteria; D:Mouldy oat grain phyla bacteria; E:Normal oat grain genus fungus; F:Mouldy oat grain genus fungus; G:Normal oat grain genus bacteria; H:Mouldy oat grain genus bacteria.

圖4優(yōu)勢(shì)微生物群落門類組成分布圖

Fig.4Relativedistributionofthemostabundantmicrobefromdifferentphylaandgenusinthetwosamples

燕麥作為一種具有保健功能的食品，生育后期多雨會(huì)導(dǎo)致籽粒表面出現(xiàn)不同程度霉變現(xiàn)象，嚴(yán)重影響燕麥產(chǎn)品品質(zhì)，要預(yù)防該病害的發(fā)生，除了選擇適宜的種植區(qū)，應(yīng)進(jìn)一步確定引起霉變的菌種，加強(qiáng)拮抗菌的研究，利用生物防治以確保生產(chǎn)合格的燕麥原料。

參考文獻(xiàn)：

[1] 許孟會(huì),趙 輝,王 晉,等．春季低溫連陰雨對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響及防御[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(6):65．

XU M H,ZHAO H,WANG J,etal. Effects of low temperature and continuous rain on crops in spring and its preventive strategies [J].HunanAgriculturalSciences,2009(6):65．

[2] 吳洪顏,高 蘋,趙 凱.春季連陰雨對(duì)江蘇省夏收作物產(chǎn)量的影響[J].災(zāi)害學(xué),2003,18(3):46．

WU H Y,GAO P,ZHAO K. The impact of continuous rain in spring on the summer harvest in Jiangsu Province [J].JournalofCatastrophology,2003,18(3):46．

[3] MCMULLEN M,JONES R,GALLENBERG D.Scab of wheat and barley:A re-emerging disease of devastating impact [J].PlantDisease,1997,81(12):1342.

[4] 陳曉娟,文成敬．四川省玉米穗腐病研究初報(bào)[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2002,24(1):23.

CHEN X J,WEN C J. Preliminary study of maize ear rot in Sichuan [J].JournalofSouthwestAgriculturalUniversity,2002,24(1):23.

[5] 鄒小波,趙杰文. 電子鼻快速檢測(cè)谷物霉變的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2004,20(4):121.

ZOU X B,ZHAO J W. Rapid identification of moldy corn by electronic nose [J].TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineering,2004,20(4):121.

[6] 尹芳緣,黃 潔,王敏敏,等.用電子鼻區(qū)分霉變燕麥及其傳感器陣列優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2013,29(20):263.

YING F Y,HUANG J,WANG M M,etal. Discrimination of mildewed oats using electronic nose and optimization of its sensor array [J].TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineering,2013,29(20):263.

[7] HANDELSMAN J. Metagenomics:Application of genomics to uncultured microorganisms [J].MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,2004,68(4):671.

[8] 王 鵬,陳 波,張 華. 基于高通量測(cè)序的鄱陽(yáng)湖典型濕地土壤細(xì)菌群落特征分析[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(5):1653.

WANG P,CHEN B,ZHANG H. High throughput sequencing analysis of bacterial communities in soils of a typical Poyang Lake wetland [J].ActaEcologySinica,2017,37(5):1653.

[9] 滕嘉玲,賈榮亮,趙 蕓.沙埋對(duì)干旱沙區(qū)真蘚結(jié)皮層細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(7):2181.

TANG J L,JIA R L,ZHAO Y. Impact of sand burial on bacterial community structure and diversity within biocrusts dominated byBryumargenteum[J].ActaEcologicaSinica,2017,37(5):2181.

[10] CAPORASO J G,KUCZYNSKI J,STOMBAUGH J,etal. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data [J].NatureMethods,2001,7(5):335.

[11] SCHLOSS P D,WESTCOTT S L,RYABIN T,etal. Introducing mothur:Open-source,platform-independent,community-supported software for describing and comparing microbial communities [J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2009,75(23):7538.

[12] EDGAR R C,HAAS B J,CLEMENTE J C,etal. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection [J].Bioinformatics,2011,27(16):2197.

[13] EDGAR R C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST [J].Bioinformatics,2010,26(19):2460.

[14] ALTSCHUL S F,GISH W,MILLER W,etal. Basic local alignment search tool [J].JournalofMolecularBiology,1990,215(3):406.

[15] WHITE J R,NAGARAJAN N ,POP M.Statistical methods for detecting differentially abundant features in clinical metagenomic samples [J].PlosComputationalBiology,2009,5(4):e1000352.

[16] 張?zhí)煊?中國(guó)真菌志(第十六卷)鏈格孢屬[M].北京:科學(xué)出版社, 2003:96.

ZHANG T Y.Flora fungorum sinicorun(Vol.16)Alternaria[M].Beijing:Science Press,2003:96.

[17] FARR D F,BILLS G F,CHAMURIS G P,etal.Fungi on plants and plant products in the United States [J].Mycologia,1989,42(3):244.

[18] 李文強(qiáng),程雪蓮,趙海梅等.寧夏小麥黑胚病的病原鑒定[J].寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,22(3):19.

LI W Q,CHENG X L,ZHAO H M,etal.The pathogenetic fungi of the black embryo disease of wheat in Ningxia [J].JournalofNingxiaAgriculturalCollege,2001,22(3):19.

[19] 馬桂珍,暴增海,楊文蘭,等.河北省冬小麥種子表面粘附真菌的分離鑒定[J].種子,2002(4):16.

MA G Z,BAO Z H,YANG W L,etal.Separation and identification of seed surface carrier fungus in winter wheat from Hebei Province [J].Seed,2002(4):16.

[20] 金程凡,朱宏建,高必達(dá),等. 湖南省油菜品種的種傳鏈格孢菌檢測(cè)[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2014,36(4):502.

JIN C F,ZHU H J,GAO B D,etal.SeedborneAlternariadetection of rapeseed cultivars in Hunan Province [J].ChineseJournalofOilCropSciences,2014,36(4):502.