離子色譜法測定FAPAS比對肉粉樣品中亞硝酸鹽、硝酸鹽含量

莫紫梅，楊 黎，鄭娟梅*，陳寧周，王 警

（廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西 南寧 530021）

亞硝酸鹽和硝酸鹽常用于肉類腌制，其能保持肉類色澤、抑制微生物的生長以及產(chǎn)生特殊風(fēng)味[1]。亞硝酸鹽分解形成的一氧化氮與血紅素反應(yīng)生成亞硝基肌紅蛋白，使腌制的肉類呈粉紅色，是肉制品加工的發(fā)色劑，過量攝入可導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥[2]。亞硝酸鹽與其他鹽類結(jié)合則具有一定的抑菌作用，能夠抑制碎肉罐頭和腌肉中的梭狀芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌等[2-4]。亞硝酸鹽能與食品中的有機(jī)胺類物質(zhì)形成致癌性N-亞硝基化合物[1,3-5]。硝酸鹽在口腔和腸道微生物作用下可轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，亦可形成亞硝胺類物質(zhì)，危害人體健康[1,5]。

GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，熟肉制品中硝酸鈉（或硝酸鉀）的最大使用量為0.5 g/kg，亞硝酸根的殘留量（以亞硝酸鈉計）≤30 mg/kg，成人攝入亞硝酸鹽0.2～0.5 g就能造成中毒，攝入3 g就可造成死亡[5]。因此對腌肉制品中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的檢測和控制非常必要。

目前，測定亞硝酸鹽和硝酸鹽的方法有氣相色譜法[6]、紫外分光光度法[7-9]、熒光光度法[10]和離子色譜法[11-19]等。離子色譜法操作簡便、快速、分辨率與準(zhǔn)確度高，可同時測定多種離子，目前廣泛應(yīng)用于食品質(zhì)量與安全分析中[17-21]，如測定食品中的添加劑[22-27]、甜味劑[28-29]及其他組分[30-31]。

本研究采用抑制型電導(dǎo)法檢測由FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）提供的肉粉樣品中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，以氫氧化鉀緩沖溶液作為淋洗液進(jìn)行梯度洗脫，對經(jīng)前處理的樣品進(jìn)樣分析，將樣品中的硝酸根和亞硝酸根與有機(jī)酸及其他常見陰離子進(jìn)行分離。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉粉樣品由FAPAS提供。

亞硝酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度1 000 μg/mL，以） 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度1 000 μg/mL，以NO3－計）美國O2si公司；KOH淋洗液 美國Dionex公司；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex ICS-5000＋離子色譜儀（配備Dionex AS自動進(jìn)樣器、四元梯度分析泵、淋洗液發(fā)生器、電導(dǎo)檢測器、AERS 500（4 mm）陰離子抑制器、Chromeleon 7色譜工作站）、X3R高速冷凍離心機(jī)、Dionex OnGuardTMⅡRP柱（1 cc，使用前依次用10 mL甲醇、15 mL水靜置活化30 min）、Dionex OnGuardTMⅡ Ag柱和Dionex OnGuardTMⅡNa柱（均為1 cc，使用前用10 mL水靜置活化30 min） 美國Thermo Fisher公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國密理博公司；Mettler Toledo XS205DU電子天平（十萬分之一） 瑞士梅特勒-托利多公司；S300H超聲波清洗器 德國Elmasonic公司。

1.3 方法

1.3.1 離子色譜條件

色譜柱為D i o n e x I o n P a cTMA S 1 9陰離子柱（4 mm×250 mm）；保護(hù)柱為Dionex IonPacTMAG19（4 mm×50 mm）；淋洗液為KOH溶液，流速1.0 mL/min，梯度淋洗程序：0～21.0 min，12 mmol/L KOH；21.0～21.5 min，12～40 mmol/L KOH；21.5～27.5 min，40 mmol/L KOH；27.5～28.0 min，40～12 mmol/L KOH；28.0～35.0 min，12 mmol/L KOH；抑制器為AERS 500（4 mm），抑制電流100 mA；電導(dǎo)檢測器；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量100 μL。

1.3.2 樣品前處理

參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[18]，稱取1.00 g試樣于150 mL具塞錐形瓶中，加80 mL水，超聲提取30 min，每隔5 min振搖1 次，保持固相完全分散；于75 ℃水浴中加熱5 min，取出放置至室溫，定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容，混勻，靜置；將部分溶液轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中，于4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液備用。

取上述上清液約15 mL，依次通過0.22 μm水性濾膜針頭濾器、RP柱、Ag柱、Na柱，流速2 mL/min，棄去7 mL初始洗脫液后，收集洗脫液，注入樣品管中直接進(jìn)行色譜分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別取亞硝酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL、硝酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL于同一10 mL容量瓶中，用超純水定容，得混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，其中和的質(zhì)量濃度分別為100、500 mg/L。

移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，分別置于100 mL容量瓶中，超純水稀釋，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中的質(zhì)量濃度分別為0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/L，的質(zhì)量濃度分別為0.50、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/L。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率

將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照優(yōu)化所得色譜條件依次進(jìn)樣分析，以離子的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取樣品1.0 g，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，按照優(yōu)化所得條件測定亞硝酸鹽和硝酸鹽的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

考察Dionex IonPacTMAS19、AS15、AS11及AS11-HC 4 種不同柱容量分析柱對目標(biāo)峰的分離效果。因樣品基質(zhì)復(fù)雜，在亞硝酸鹽色譜峰前后存在未知峰干擾，后經(jīng)實驗證明為Cl－干擾，Dionex IonPacTMAS19、AS15、AS11色譜柱均能夠達(dá)到分離度要求，綜合考慮峰型對稱、峰寬拖尾、分離度及分析時間等因素，選用Dionex IonPacTMAS19柱作為分析柱。Dionex IonPacTMAS19柱能大體積進(jìn)樣，可以將樣品中的亞硝酸根離子和硝酸根離子與其他常見陰離子及有機(jī)酸良好分離，進(jìn)行高濃度樣品分析時不會出現(xiàn)過載和峰拖尾現(xiàn)象，可以使用較高濃度的氫氧根淋洗液，從而擴(kuò)大梯度淋洗范圍，滿足本研究的要求。使用Dionex IonPacTMAS19柱對樣品進(jìn)行分離的色譜圖如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of standard and sample

2.1.2 淋洗液濃度的選擇

由于肉粉成分復(fù)雜，含有多種陰離子，采用等梯度洗脫難以使各種陰離子達(dá)到良好分離。分別考察12、10、8、6 mmol/L KOH淋洗液對干擾峰與目標(biāo)峰的影響，最終選擇淋洗液的濃度為：0～21.0 min，12 mmol/L KOH；21.0～21.5 min，12～40 mmol/L K O H；2 1.5～2 7.5 m i n，4 0 m m o l/L K O H；27.5～28.0 min，40～12 mmol/L KOH；28.0～35.0 min，12 mmol/L KOH。在此條件下，目標(biāo)峰與干擾峰能較好分離。

2.1.3 抑制器電流的選擇

抑制器電流會影響背景電導(dǎo)值，當(dāng)背景電導(dǎo)值在1 μS以下時，可獲得較好的色譜分析結(jié)果。因此，在上述淋洗液梯度條件下，考察電流強(qiáng)度為60、80、100、120 mA時背景電導(dǎo)值的大小。結(jié)果表明，抑制器電流為100 mA時，背景電導(dǎo)值在1 μS以下。

2.1.4 進(jìn)樣量的選擇

考察25、50、100、250 μL的定量環(huán)，考慮到樣品中亞硝酸鹽、硝酸鹽的含量差異以及標(biāo)準(zhǔn)檢出限0.2、0.4 mg/kg的分析要求，最終選擇進(jìn)樣量為100 μL。

綜上所述，確定最佳色譜條件為：色譜柱Dionex Ion PacTMAS19陰離子柱（4 mm×250 mm）；保護(hù)柱Dionex IonPacTMAG19（4 mm×50 mm）；抑制電流100 mA；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量100 μL；流速1.0 mL/min，淋洗液梯度：0～21.0 min，12 mmol/L KOH；21.0～21.5 min，12～40 mmol/L KOH；21.5～27.5 min，40 mmol/L KOH；27.5～28.0 min，40～12 mmol/L KOH；28.0～35.0 min，12 mmol/L KOH。在此條件下，目標(biāo)峰與干擾峰能得到較好分離。

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

肉粉中含有蛋白質(zhì)，能夠水解出對色譜柱造成污染和傷害的水溶性蛋白質(zhì)，嚴(yán)重影響儀器的使用壽命。因此，樣品在經(jīng)過RP柱后能有效去除水溶性的大分子物質(zhì)。另外，肉粉、熟肉制品在加工過程中加入的食鹽等調(diào)料會干擾被測離子，特別是亞硝酸根的測定。因此，本研究采用Ag柱、Na柱，可以有效去除樣品中的金屬離子及氯離子[21]。

比較超聲時間分別為20、25、30、35 min的效果，結(jié)果表明，超聲時間為30 min時，亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量達(dá)到穩(wěn)定，因此選擇超聲時間為30 min。另外，考察樣品未水浴、75 ℃水浴3 min、75 ℃水浴5 min及75 ℃水浴10 min幾種前處理方式的效果，結(jié)果表明，75 ℃水浴5 min時，亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量達(dá)到穩(wěn)定，如表1所示。

表1 不同前處理條件下亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量Table 1 Contents of nitrite and nitrate under different pretreatment conditions

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率

將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照優(yōu)化所得色譜條件依次進(jìn)樣分析，以離子的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，亞硝酸根和硝酸根的線性方程依次為y=0.865x－0.010、y=0.697x－0.057，相關(guān)系數(shù)均為0.999 9。

由表2～3可知，亞硝酸鹽（以NaNO2計）的平均回收率為99.53%，RSD=0.60%，硝酸鹽（以NaNO3計）的平均回收率為99.29%，RSD=0.25%，這表明該測定方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。

表2 亞硝酸鹽（以NaNO2計）的回收率測定結(jié)果（n=9）Table 2 Recoveries of nitrite (NaNO2) in spiked samples (n= 9 )

表3 硝酸鹽（以NaNO3計）的回收率測定結(jié)果（n= 9）Table 3 Recoveries of nitrate (NaNO3) in spiked samples (n= 9)

2.4 樣品測定結(jié)果

表4 FAPAS比對樣品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定結(jié)果Table 4 Contents of nitrite (NaNO2) and nitrate (NaNO3) of FAPAS sample determined by ion chromatography

由表4可知，F(xiàn)APAS比對樣品中亞硝酸鹽（以NaNO2計）的含量為108.3 mg/kg，硝酸鹽（以NaNO3計）含量為426.9 mg/kg，而參加此次FAPAS比對的83 家實驗室的樣品測定平均值為：亞硝酸鹽（以NaNO2計）111.0 mg/kg，硝酸鹽（以NaNO3計）428.0 mg/kg。本次比對結(jié)果為“滿意”，亞硝酸鹽（以NaNO2計）測定結(jié)果偏離Z值為－0.2，硝酸鹽（以NaNO3計）測定結(jié)果偏離Z值為0.0（“滿意”要求∣Z∣≤2），表明本研究確定的方法科學(xué)、可靠、精準(zhǔn)。

3 結(jié) 論

本研究采用離子色譜法同時測定熟肉制品的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量，所確定的前處理方法能夠有效去除樣品中的無機(jī)陰離子、陽離子及有機(jī)成分的干擾，測定結(jié)果可靠，具有一定的應(yīng)用價值。

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