趙 瀛, 張春燕, 郭奕超, 戴 謙, 王蓓麗*, 郭 瑋, 潘柏申,2
1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科,上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科,廈門 361015
原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一,約占肝癌的80%,惡性程度高,患者生存率較低[1]。2016年的全球數(shù)據(jù)表明,肝癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第4位,死亡率位居第2位[2]。目前HCC最有效的治療手段仍然是手術(shù)。但HCC患者早期癥狀不典型,確診時一般處于中晚期,基本喪失了手術(shù)機會或手術(shù)預(yù)后不佳。因此,尋找有效的早期診斷及預(yù)后判斷生物標(biāo)志物是HCC臨床診治的關(guān)鍵。
腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的主要原因,在腫瘤早期就已存在,與腫瘤的基因編碼改變有關(guān)[3],且在病變極早期就可通過血行轉(zhuǎn)移[4],與腫瘤細(xì)胞動力密切相關(guān)。絲切蛋白1(cofilin 1)是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白,能調(diào)控細(xì)胞偽足的形成過程,是調(diào)控細(xì)胞動力的重要環(huán)節(jié),與胃癌[5]、前列腺癌[6]和乳腺癌[7]等多種腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。我們的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)HCC患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTC)與HCC組織細(xì)胞中cofilin 1蛋白表達(dá)存在顯著差異,提示cofilin 1蛋白表達(dá)與HCC預(yù)后相關(guān)。因此,本研究進(jìn)一步探討HCC組織cofilin 1蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性,為HCC的臨床診治提供新的研究靶標(biāo),改善患者預(yù)后。
1.1 一般資料 選取2012年12月至2014年5月確診為HCC,并于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受肝癌切除術(shù)的126例患者作為研究對象。其中,男性101例,女性25例;年齡(54±11)歲,>50歲73例、小于或等于50歲53例,患者人口學(xué)特征及基線資料詳見表1。根據(jù)所選病例手術(shù)切除標(biāo)本病理號將其相應(yīng)的石蠟包埋標(biāo)本取出,挑選組織完整清晰的部分。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn),所有患者均知情同意并簽署知情同意書。
1.2 免疫組織化學(xué)染色 HCC組織切片在二甲苯脫蠟、乙醇水化后,置于抗原修復(fù)液(50×EDTA 抗原修復(fù)液,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)中微波修復(fù)9 min,3%過氧化氫溶液中浸泡15 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性;PBS漂洗3次,5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min,加入小鼠抗人cofilin 1單克隆抗體(一抗,OriGene Technologies),4℃孵育過夜。PBS代替一抗,作為空白對照。次日PBS 漂洗3 次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(二抗,工作液體積稀釋比例為1∶5 000,OriGene Technologies),室溫孵育60 min。DAB顯色液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)顯色8 min,蘇木精對比染色20 s,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠固封。
表1 兩組患者人口學(xué)特征及基線資料比較 n, N=126
AFP:甲胎蛋白;BCLC分期:巴塞羅那臨床肝癌分組方案
1.3 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用Pannoramic Viewer軟件對細(xì)胞染色結(jié)果進(jìn)行檢測和半定量評分。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒,判斷為cofilin 1陽性細(xì)胞。根據(jù)染色強度(強,3分;中,2分;弱,1分;無,0分)和陽性細(xì)胞百分率(4分,>80%;3分,51%~80%;2分,11%~50%;1分,≤10%;0分,無陽性細(xì)胞)的乘積計算總評分[8](圖1)??偡?分及以上列為cofilin 1高表達(dá)組,未達(dá)8分則為cofilin 1低表達(dá)組。
圖1 免疫組織化學(xué)染色評分標(biāo)準(zhǔn)(DAB染色)
A: 0分; B: 1分; C: 2分; D: 3分. Original magnification: ×160(基礎(chǔ)圖片), ×1 100(放大部分)
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0和GraphPad prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用Spearman相關(guān)分析法分析cofilin 1蛋白表達(dá)與HCC患者臨床參數(shù)的相關(guān)性。采用生存分析法繪制無病生存(disease-free survival,DFS)與總生存(overall survival,OS)曲線圖,探討cofilin 1蛋白表達(dá)與HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)或生存相關(guān)性。采用Cox回歸風(fēng)險比例模型分析影響HCC患者在腫瘤切除術(shù)后生存與早期復(fù)發(fā)的獨立危險因素,計算風(fēng)險比(hazard ratio, HR)和95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。
2.1 肝癌組織cofilin 1蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(圖2)表明:HCC組織cofilin 1高表達(dá)組35例;cofilin 1蛋白低表達(dá)組91例。
2.2 Cofilin 1蛋白表達(dá)與HCC患者臨床參數(shù)的Spearman相關(guān)性 結(jié)果(表2)表明:cofilin 1蛋白表達(dá)評分與患者術(shù)前甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)水平、腫瘤大小及巴塞羅那臨床肝癌分組方案(BCLC分期)正相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而cofilin 1蛋白表達(dá)評分與術(shù)后AFP水平、術(shù)前術(shù)后γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase, γ-GT)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)、腫瘤包膜完整性和肝硬化及血管侵犯等臨床指標(biāo)無明顯相關(guān)性。
圖2 免疫組織化學(xué)染色測定肝癌組織cofilin 1蛋白的表達(dá)(DAB染色)
A: 肝癌組織cofilin 1蛋白高表達(dá); B:肝癌組織cofilin 1蛋白低表達(dá). Original magnification: ×160(基礎(chǔ)圖片), ×1 100(放大部分)
表2 Cofilin 1蛋白表達(dá)評分與HCC患者臨床參數(shù)的Spearman相關(guān)性分析 N=126
AFP:甲胎蛋白;γ-GT:γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶;ALT:谷丙轉(zhuǎn)氨酶;BCLC分期:巴塞羅那臨床肝癌分組方案
2.3 Cofilin 1蛋白表達(dá)水平與HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性 結(jié)果(圖3)表明:cofilin 1高表達(dá)患者術(shù)后DFS明顯短于低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 1)。臨床亞組分析結(jié)果表明:BCLC分期0/A期亞組(P=0.000 4)和腫瘤直徑<5 cm亞組(P=0.000 1)中cofilin 1高表達(dá)患者術(shù)后DFS明顯短于低表達(dá)患者;而AFP<20 ng/mL亞組(P=0.050 0)和未侵襲亞組(P=0.179 3)中cofilin 1高低表達(dá)患者術(shù)后DFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
A:全組(P=0.000 1); B: BCLC分期0/A期亞組(P=0.000 4); C:腫瘤直徑<5 cm亞組(P=0.000 1);D:AFP<20 ng/mL亞組(P=0.05); E:未侵襲亞組(P=0.179 3)
2.4 Cofilin 1蛋白表達(dá)水平與HCC患者生存情況的相關(guān)性 結(jié)果(圖4)表明:Cofilin 1蛋白低表達(dá)組HCC患者術(shù)后OS明顯長于高表達(dá)組患者(P=0.004 1);臨床亞組分析結(jié)果表明:BCLC分期0/A期亞組(P=0.001 3)和腫瘤直徑<5 cm亞組(P=0.006 0)cofilin 1蛋白低表達(dá)組HCC患者術(shù)后OS時間明顯長于高表達(dá)組患者(P=0.006 0),而在AFP<20 ng/mL亞組(P=0.324 8)和未侵襲亞組(P=0.075 5)中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.5 HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)與生存的危險因素分析 Cox回歸風(fēng)險比例模型單因素分析(表3)發(fā)現(xiàn):cofilin 1蛋白表達(dá)高低對患者術(shù)后復(fù)發(fā)有預(yù)測價值(P=0.025),肝硬化、腫瘤直徑大于5 cm、微血管侵犯和CTC高是預(yù)后不良的復(fù)發(fā)因素(P<0.05);cofilin 1蛋白表達(dá)高低對患者術(shù)后生存也有預(yù)測價值(P=0.004),腫瘤直徑>5 cm及BCLC分期為B/C是影響術(shù)后生存的顯著因素(P<0.05)。
多因素分析結(jié)果(表3)顯示:cofilin 1蛋白高表達(dá)(HR=1.647,95%CI 1.015~2.672)、肝硬化(HR=2.044, 95%CI 1.133~3.688)、腫瘤直徑大于5 cm(HR=1.989,95%CI 1.235~3.203)和高CTC(HR=1.795,95%CI 1.015~3.173)是導(dǎo)致HCC患者肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素;而cofilin 1蛋白高表達(dá)(HR=2.412,95%CI 1.696~4.940)和腫瘤直徑>5 cm(HR=2.461,95%CI 1.367~4.429)是術(shù)后生存的獨立危險因素。
圖 4 Cofilin 1蛋白表達(dá)水平與各組HCC患者術(shù)后生存情況的相關(guān)性
A:全組(P=0.004 1); B: BCLC分期0/A期亞組(P=0.001 3); C:腫瘤直徑<5 cm亞組(P=0.006 0); D: AFP<20 ng/mL亞組(P=0.324 8); E:未侵襲亞組(P=0.075 5)
CTC作為腫瘤原發(fā)灶播散的“種子”,在腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用[9]。本課題組預(yù)實驗發(fā)現(xiàn),CTC可作為HCC診斷及預(yù)后的標(biāo)志物;通過對CTC高與CTC低的兩組HCC患者原發(fā)灶的表達(dá)譜芯片進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)兩組HCC患者cofilin 1表達(dá)差異顯著,提示cofilin 1可能是導(dǎo)致CTC釋放入外周血的關(guān)鍵分子,具有重大的研究價值及意義。因此,本研究旨在驗證cofilin 1在HCC根治術(shù)后療效監(jiān)測和預(yù)后評估中的價值。
本研究入組了2012年12月至2014年5月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受肝癌切除術(shù)的HCC患者126例,對患者術(shù)后的組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,并對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),cofilin 1表達(dá)與患者術(shù)前AFP、腫瘤大小及BCLC分期相關(guān)。進(jìn)一步利用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn):cofilin 1是HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后危險因素;在一些低危亞組,如BCLC分期0/A期亞組和腫瘤<5 cm亞組中,cofilin 1高低表達(dá)的HCC患者發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)的差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本研究證實cofilin 1是良好的預(yù)后標(biāo)志物,且在臨床上對患者預(yù)后進(jìn)行評估時,比BCLC分期及腫瘤大小更靈敏。
表3 HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)與生存的單因素及多因素風(fēng)險分析
HR:風(fēng)險比(hazard ratio);95%CI:95%可信區(qū)間;AFP:甲胎蛋白;ALT:谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase);HBsAg:乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen);BCLC分期:巴塞羅那臨床肝癌分組方案;TTR:復(fù)發(fā)時間(time to recurrence);OS:總生存時間(overall survival)
Cofilin 1主要通過腫瘤轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞動力增強、細(xì)胞分裂和細(xì)胞轉(zhuǎn)化啟動對腫瘤細(xì)胞起到調(diào)控作用[10]。Wiskott Aldrich綜合征蛋白家族、肌動蛋白相關(guān)2/3復(fù)合體和肌動蛋白單體主導(dǎo)著突觸形成的過程[11],而cofilin 1對肌動蛋白單體起到關(guān)鍵的調(diào)控作用,提示cofilin 1是使腫瘤細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫\動狀態(tài)的重要因素。
綜上所述,在肝癌臨床診治中,cofilin 1可作為一個用來有效篩選具有較高復(fù)發(fā)風(fēng)險患者的潛在指標(biāo),從而輔助臨床采取相應(yīng)措施,實施不同的治療策略,制訂個體化的醫(yī)療方案,實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。在后續(xù)的研究中,本課題組會針對cofilin 1的上游調(diào)控因子及相應(yīng)通路進(jìn)行深入探索,并且進(jìn)一步探討cofilin 1與細(xì)胞運動相關(guān)的分子機制。
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