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    AFB1與吸附劑對牦牛瘤胃發(fā)酵性能的影響

    2018-05-03 06:04:56李子謙文勇立齊沛森安雅靜趙佳琦安德科
    關(guān)鍵詞:胃液牦牛微量元素

    李子謙,文勇立*,齊沛森,安雅靜,李 鑄,艾 鷖,趙佳琦,李 強,安德科

    (1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院,成都 610041;2.四川省畜牧總站,成都 610041;3.金川縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心,四川 金川 624100)

    牦牛分布于我國青藏高原,我國占世界總量90%以上,是當(dāng)?shù)刂匾a(chǎn)生活資料及地方經(jīng)濟發(fā)展支柱。傳統(tǒng)牦牛飼養(yǎng)依靠純天然放牧,生產(chǎn)方式落后,經(jīng)濟效益較低。隨生產(chǎn)方式改進,逐漸開展牦牛舍飼、半舍飼養(yǎng)殖。但牦牛飼料易受霉菌毒素污染,影響健康和產(chǎn)品安全。因此,研究霉菌毒素對牦牛瘤胃發(fā)酵影響利于牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展。我國部分地區(qū)飼料及原料黃曲霉毒素B1(Aflatoxins B1,AFB1)含量達11.2 μg·kg-1,粕類達47.6 μg·kg-1[1]。一般選擇酵母細胞壁提取物(Yeast cell wall extract,YCW)和蒙脫石(Montmorillonite,MMT)作霉菌毒素脫毒劑。YCW結(jié)構(gòu)中β-葡聚糖(β-glucan)是吸附活性成分,可與霉菌毒素分子相互作用結(jié)合排出體外[2-3]。YCW中甘露寡糖(Mannan-oligosaccha?rides,MOS)可促進瘤胃有益菌增殖[4-6]。MMT在干燥條件下與AFB1間主要以離子偶極相互作用或交換陽離子/羰基氧配位結(jié)合,濕潤條件下主要以交換陽離子水化膜和羰基間形成氫鍵結(jié)合[7]。Seeling等對體外瘤胃微生物靜態(tài)培養(yǎng)表明,隨AFB1濃度增加,氨氮(NH3-H)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度及甲烷產(chǎn)量下降,且抑制羧甲基纖維素酶和微晶纖維素酶活性[8-10]。除pH、NH3-H、VFA等外,微量元素通過影響瘤胃微生物代謝與發(fā)酵性能關(guān)系密切[11]。有關(guān)吸附劑及AFB1對微量元素影響,朱金林等研究表明,不同吸附劑對微量元素具有不同程度吸附作用,僅見硒(Se)對其AFB1毒性具有緩解作用[12-14]。目前研究多基于體外試驗,涉及瘤胃氨氮(NH3-H)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)及纖維素酶活性等報道較少[15]。另外,Kutz等吸附劑研究表明,水合鋁硅酸鈣鈉(HSCAS)可降低乳中黃曲霉毒素M1(Aflatoxins M1,AFM1)轉(zhuǎn)化率,YCW物可降低機體對AFB1吸收[16-17]。本研究以牦牛為試驗對象,在飼料中添加不同水平AFB1及3種吸附劑處理:MMT、YCW、MMT+YCW,分析AFB1和吸附劑對牦牛瘤胃發(fā)酵性能影響。旨為AFB1影響瘤胃性能相關(guān)研究積累資料,為反芻動物飼料安全和吸附劑應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    主要儀器:pH計8362sc(購自美國哈希公司);漩渦振蕩器XH-B(購自上海汗諾儀器有限公司);紫外可見分光光度計UV-9000S(購自上海元析儀器有限公司);氣相色譜儀LC-20A(購自日本島津儀器公司);超聲波細胞破碎儀JY92-IIN(購自寧波新芝生物科技股份有限公司);恒溫水浴搖床WHY-2A(購自常州市華怡儀器制造有限公司);iCAP6000全譜直讀型臺式ICP光譜儀(購自美國Thermo Fisher Scientific Inc.公司)。

    主要試劑:AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(99.5%),購自以色列FERMENTEK公司;蒙脫石(>95%),購自赤峰和明生化有限公司;酵母細胞壁提取物(甘露寡糖≥20%),購自安琪酵母股份有限公司;L-乳酸(≥98%)、偏磷酸(≥98%)、對羥基聯(lián)苯(≥99%)、微晶纖維素(≥99%)、羧甲基纖維素鈉(≥99%)、水楊苷(≥98%)、木聚糖(≥95%)、濃硝酸(≥68%)等,購自上海瀚思化工有限公司。

    1.2 動物分組與處理

    2017年9月在四川省阿壩藏族羌族自治州茂縣茂興牦牛養(yǎng)殖場選擇16頭健康、發(fā)育正常,36月齡公牦牛,平均體重為195.8 kg。試驗牦牛飼養(yǎng)管理條件一致,自由采食和飲水。日糧精粗比1∶4,精料為豆粕(40%)和玉米粉(60%)。試驗采用2因素4水平完全正交試驗設(shè)計法(見表1),對AFB1與吸附劑處理作主效應(yīng)方差分析,AFB1水平:A(20 μg·kg-1)、B(40 μg·kg-1),C(60 μg·kg-1)、對照組,吸附劑處理:Ⅰ(MMT 50 g·頭-1·d-1)、Ⅱ(YCW 50 g·頭-1·d-1)、Ⅲ(MMT 25 g·頭-1·d-1+YCW 25 g·頭-1·d-1)、對照組。投喂7 d。每天6:00,18:00兩次飼喂。每日6:00先將AFB1和吸附劑摻入一小撮精料中,混勻,待牦牛全部采食后,投喂剩余飼料。

    表1 2因素4水平完全正交試驗設(shè)計Table 1 Two factors and four levels complete orthogonal design

    1.3 樣品采集與制備

    于第8天采集瘤胃液,飼喂后2 h,用負壓采集器,經(jīng)導(dǎo)管通過口腔食道,深入到瘤胃內(nèi)中部,為防止唾液污染,棄去前一部分,采集瘤胃液約100 mL。一部分樣品經(jīng)過4層紗布過濾,立即測定pH,分裝-72°C保存,用于NH3-N、VFA濃度測定;另一部分樣品不過濾,直接分裝-72°C保存,用于微生物蛋白(MCP)、纖維素酶活性(微晶纖維素酶、羧甲基纖維素酶、纖維二糖酶和木聚糖酶)測定。

    1.4 測定指標(biāo)及方法

    1.4.1 瘤胃發(fā)酵性能指標(biāo)測定

    優(yōu)化對羥基聯(lián)苯法定量測定乳酸濃度,參照文獻[18];比色法測定NH3-N濃度,參照文獻[19];氣相色譜法外標(biāo)法測定VFA濃度,嘌呤法測定MCP濃度,參照文獻[20];纖維降解酶活性測定參照文獻[21]。

    1.4.2 瘤胃液微量元素的測定

    取過濾瘤胃液5 mL于潔凈三角瓶中,加入約100 mL濃硝酸。先將電熱板溫度調(diào)至200℃低溫消解,待達到硝酸分解溫度后,將電熱板升溫至400℃。加熱期間瓶中液體低于20 mL時,可加入適量濃硝酸。待瓶內(nèi)液體澄清,所剩液體約5 mL時,取下冷卻,用10%硝酸于10 mL定容管中定容,收集濾液測定ICP-OES。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    用SPSS作2因素4水平方差分析,估計因子效應(yīng),用LSD作行多重比較。結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 AFB1對瘤胃發(fā)酵性能影響

    由表2可知,AFB1顯著降低瘤胃pH、NH3-H、總VFA、乙酸、丙酸戊酸濃度、微晶纖維素酶、纖維二糖酶、木聚糖酶活性(P<0.01或P<0.05)。丁酸、MCP、乳酸濃度濃度、羧甲基纖維素酶活性隨AFB1濃度升高而降低(P>0.05)。AFB1在60 μg·kg-1水平下,纖維二糖酶活性顯著低于對照組(P<0.05),表明當(dāng) AFB1濃度達 60 μg·kg-1時,對該指標(biāo)影響具有統(tǒng)計學(xué)意義,為最低危害濃度;在40、60 μg·kg-1水平下,木聚糖酶活性顯著低于對照組(P<0.05),表明當(dāng)AFB1濃度達到40 μg·kg-1時,對該指標(biāo)影響具有統(tǒng)計學(xué)意義,為最低危害濃度。

    2.2 AFB1對瘤胃液微量元素含量影響

    由表3可知,隨AFB1水平升高,瘤胃液Fe、Cu、Zn、Mn、Se含量極顯著或顯著降低(P<0.01或P<0.05)。

    表2 AFB1對瘤胃發(fā)酵性能影響Table 2 Effect of AFB1 on the rumen fermentation performance

    表3 AFB1對微量元素影響Table 3 Effect of AFB1 on trace elements (mg·L-1)

    2.3 吸附劑對瘤胃發(fā)酵性能影響

    由表4可知,3種吸附劑處理均不同程度降低乙丙比和提高總VFA、乙酸、丙酸、丁酸MCP濃度、羧甲基纖維素酶活性,效應(yīng)順序為Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ,但僅見YCW具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

    混合處理組(MMT+YCW)效果大于對照組和MMT組,但小于YCW組。

    2.4 吸附劑對瘤胃液微量元素影響

    由表5可知,3種吸附劑處理均不同程度降低Fe、Cu、Zn、Mn、Se含量(P>0.05),其降低程度由高到低為Ⅰ>Ⅲ>Ⅱ。

    表4 吸附劑對瘤胃發(fā)酵性能影響Table 4 Effects of adsorbents on the rumen fermentation performance

    表5 吸附劑對微量元素影響Table 5 Effects of adsorbents on trace elements(mg·L-1)

    3 討 論

    3.1 AFB1對瘤胃發(fā)酵性能影響

    對照組pH為6.25,處于正常范圍[22]。處理組為5.51~5.83。Mould等研究指出,當(dāng)pH≤6.0時,纖維降解菌活性完全受抑制[23]。顯示牦牛瘤胃纖維降解受AFB1影響。齊琪基于瘤胃微生物體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)AFB1對羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶和纖維分解菌酶活性有抑制作用[10]。本研究結(jié)果與體外試驗報道結(jié)果一致,表明AFB1降低牦牛瘤胃pH同時影響瘤胃纖維降解作用。對照組NH3-H濃度為8.96 mg·dL-1,處于正常范圍,處理組為6.77~7.22 mg·dL-1,低于正常范圍[24]。由于NH3-H濃度與蛋白利用率有關(guān),表明AFB1影響牦牛蛋白利用率。Dengler等VFA轉(zhuǎn)運的分子機制研究認為,VFA與組織新陳代謝有關(guān)[25],Jiang等通過瘤胃微生物體外靜態(tài)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)AFB1濃度升高,總VFA、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度下降[26],本試驗結(jié)果與其相符,因此驗證體內(nèi)試驗與體外試驗結(jié)果一致,顯示牦牛新陳代謝受到AFB1抑制。Mojtahedi等通過體外發(fā)酵試驗,發(fā)現(xiàn)在含有AFB1培養(yǎng)基中,干物質(zhì)消化率顯著降低[27-28]。Burmeister等采用主要成分為AFB1的霉菌毒素(AFs)粗提物,研究微生物對該粗提物敏感性,發(fā)現(xiàn)與MCP合成相關(guān)芽孢桿菌、梭菌和鏈霉菌受抑制[29],與本研究AFB1影響MCP結(jié)果一致。目前未見AFB1對瘤胃乳酸濃度影響報道,但瘤胃乳酸濃度過高可引起動物急性酸中毒,還可導(dǎo)致動物出現(xiàn)瘤胃炎和肝水腫等疾病[30-32]。本研究發(fā)現(xiàn)AFB1影響乳酸代謝,可能引起牦牛酸中毒或發(fā)生瘤胃及肝臟疾病風(fēng)險。目前未見AFB1對微量元素影響相關(guān)研究,Se可以降低AFB1對動物毒性,但作用機制尚不明確[13-14]。本研究AFB1降低瘤胃液Se、Fe、Cu、Zn、Mn含量(P>0.05),推測Se等微量元素與AFB1存在與吸附劑類似結(jié)合作用,可能在動物體內(nèi)與AFB1結(jié)合排出體外,降低瘤胃液中微量元素含量。

    3.2 吸附劑對發(fā)酵性能影響

    本研究通過測定瘤胃發(fā)酵性能等相關(guān)指標(biāo)分析MMT和YCW對AFB1吸附效果,表明兩種吸附劑具有較好作用。MMT屬硅鋁酸鹽類吸附劑,可以吸水膨脹形成觸變凝膠體,具有離子交換能力,且可以調(diào)節(jié)瘤胃微生物發(fā)酵。在飼料中添加硅鋁酸鹽類鈉基膨潤土,可使總VFA濃度升高[33-35]。本研究MMT提高總VFA濃度與其吸附作用和對瘤胃微生物調(diào)節(jié)作用有關(guān)。針對YCW吸附作用研究,Ehrlich等認為特殊鍵結(jié)方式和分子氫鍵使YCW中β-葡聚糖呈螺旋結(jié)構(gòu)可與多種霉菌毒素形成互補構(gòu)造,通過腸道排出動物體外[35-37]。同時,YCW中甘露寡糖(MOS)具有改善瘤胃菌群結(jié)構(gòu)和內(nèi)環(huán)境功能作用。陳志龍等研究表明,日糧中添加MOS顯著提高瘤胃中原蟲、真菌數(shù)量,提高VFA、MCP濃度[5-6]。本研究顯示YCW效果優(yōu)于MMT,可能因YCW在吸附AFB1同時,疊加其結(jié)構(gòu)中MOS對瘤胃菌群結(jié)構(gòu)有益生理效應(yīng)。朱金林等研究表明,吸附劑可以吸附Cu、Fe、Mn、Zn等微量元素,其中無機類吸附劑吸附效果顯著高于有機類[12]。本研究3種吸附劑處理均降低微量元素含量,且MMT效應(yīng)大于YCW,吸附劑雖可抑制AFB1毒性,同時也吸附動物所需微量元素,影響機體對微量元素利用。因此,生產(chǎn)上應(yīng)用吸附劑的同時,還應(yīng)考慮補充微量元素。由于YCW對AFB1吸附作用大于MMT,但對微量元素吸附作用小于MMT,說明YCW綜合效果較優(yōu)。

    本研究中,當(dāng) AFB1 濃度為 20 μg·kg-1時,NH3-H、戊酸濃度及微晶纖維素酶活性差異顯著(P<0.05),因此有必要在20 μg·kg-1以下范圍設(shè)置濃度梯度試驗,確定最低危害濃度。此外,目前尚未見吸附劑最優(yōu)劑量報道。本研究僅采用產(chǎn)品推薦劑量,應(yīng)通過兩種吸附劑濃度梯度試驗確定MMT與YCW最優(yōu)劑量;MMT+YCW處理組結(jié)果尚不能說明是否存在協(xié)同效應(yīng),可能與未設(shè)置吸附劑濃度梯度有關(guān)。

    4 結(jié)論

    AFB1對牦牛瘤胃發(fā)酵具有負面影響,且濃度越高,影響越大;AFB1可降低瘤胃液微量元素含量;3種吸附劑處理均可抑制AFB1對牦牛瘤胃微生物毒性,其中YCW效果較優(yōu)。

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