復(fù)方利福昔明納米乳的制備及質(zhì)量評價

邊益慶，高 嫻

（榆林市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西 榆林 719000）

利福昔明（rifaximin）的化學(xué)名為 4-脫氧-4′-甲基吡啶并［1′，2′-1，2］咪唑并［5，4-C］利福霉素SV，分子式C43H51N3O11，是由意大利阿爾法韋斯曼公司研制開發(fā)的一種半合成廣譜腸道殺菌藥物［1］。利福昔明和其他利福霉素類抗生素一樣，通過與細菌DNA依賴RNA聚合酶的β-亞單位不可逆地結(jié)合從而抑制細菌RNA的合成，進而抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。其與酶的結(jié)合是不可逆的，因此，對敏感菌表現(xiàn)為殺菌作用。利福昔明的抗菌譜廣，對多數(shù)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌，包括需氧菌和厭氧菌均具有殺菌作用。利福昔明口服不被腸道吸收，通過殺滅腸道的病原體而在局部發(fā)揮抗菌作用，臨床上主要用于治療腸道感染、結(jié)腸憩室等，是安全、有效的術(shù)前、術(shù)后腸道預(yù)防用藥［2］。利福昔明易溶于乙醇、乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑，不溶于水，目前常用的劑型主要有片劑、干混懸劑，不方便畜禽用藥。

納米乳（nanoemulsion，NE）是一種由水相、表面活性劑、助表面活性劑、油相等以適當比例混合而成的分散體系，其外觀澄清透明或略渾濁，熱力學(xué)穩(wěn)定，各向同性，乳滴粒徑小于100 nm［3］。 納米乳可改善水難溶性藥物在制劑中的溶解性，提高藥物的生物利用度，增強藥物穩(wěn)定性，方便給藥。

該試驗針對利福昔明臨床應(yīng)用中存在的問題，結(jié)合納米乳給藥體系的優(yōu)勢，制備復(fù)方利福昔明納米乳，并對其理化性質(zhì)進行考查，以期為獸醫(yī)臨床提供一種安全、高效、穩(wěn)定的納米藥物。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

UV-2450型紫外—可見分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品；HZ8802S恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司產(chǎn)品；激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司產(chǎn)品；Incubatos SKIP 02.420電熱恒溫培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；78HW-1型恒溫磁力攪拌器，杭州儀表電機廠產(chǎn)品；TGL-16B臺式高速冷凍離心機，湖南星科儀器有限公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡，日本JEOL公司產(chǎn)品。

利福昔明，購自廣東韶關(guān)市集琦藥業(yè)有限公司；丁香酚、肉桂醛、香芹酚、杉木油，購自江西恒誠天然香料油有限公司；聚氧乙烯醚-40-蓖麻油（EL-40）、聚氧乙烯醚-40-氫化蓖麻油（RH-40）、Tween-80，購自山東天道生物工程有限公司；無水乙醇、聚乙二醇-200（PEG-200）、聚乙二醇-400（PEG-400），購自西安市三浦化學(xué)試劑有限公司。

1.2 復(fù)方利福昔明納米乳的配方篩選與制備

1.2.1 篩選油相：利福昔明易溶于大多數(shù)有機溶劑中，難溶于水溶性溶劑，因此，選擇將藥物溶解在油相中。根據(jù)藥物在各種油脂（丁香酚、香芹酚、肉桂醛、杉木油）中的溶解性，篩選出溶解度最大的油脂作為油相。將過量的利福昔明溶解在不同的油脂中，24 h后取上清液，用紫外—可見分光光度計檢測利福昔明在各種油脂中的溶解度。

1.2.2 篩選表面活性劑：室溫下，將利福昔明溶于已篩選出的油相中，與親水親油平衡值（HLB）在8～16的3種藥劑學(xué)常用表面活性劑EL-40、RH-40、Tween-80 分別按質(zhì)量比 9∶1～1∶9 混勻。 邊攪拌邊逐滴加入蒸餾水，觀察是否能形成透明、澄清的液體，記錄相變點（體系由黏稠變?yōu)橄”〉臓顟B(tài)）加入的蒸餾水質(zhì)量，繼續(xù)逐滴加入蒸餾水至燒杯內(nèi)液體澄清、透明且不分層。以油相、水相、表面活性劑為3個頂點，運用Origin Pro 8.5軟件繪制偽三元相圖，選擇乳區(qū)面積最大的表面活性劑。

1.2.3 篩選助表面活性劑：助表面活性劑以中鏈以及短鏈為主，同時應(yīng)選擇毒性較小或者無毒的醇類。該試驗通過測試利福昔明在不同助表面活性劑中的溶解度進行篩選。將過量的藥物溶解在不同的助表面活性劑中，24 h后取上清液，用紫外—可見分光光度計檢測利福昔明在不同助表面活性劑中的溶解度，以選擇適宜的助表面活性劑。

1.2.4 確定Km值 （表面活性劑/助表面活性劑質(zhì)量比）：室溫下，將篩選出的表面活性劑和助表面活性劑分別按質(zhì)量比 5∶1、4∶1、3∶1 混勻，然后與篩選出的油相分別按質(zhì)量比9∶1～1∶1混勻，邊攪拌邊逐滴加入蒸餾水，記錄相變點滴加的蒸餾水質(zhì)量，繼續(xù)滴加直至燒杯內(nèi)液體徹底澄清、透明。以水相、表面活性劑和助表面活性劑、油相為3個頂點，運用Origin Pro 8.5軟件繪制偽三元相圖，選擇乳區(qū)面積最大的偽三元相圖對應(yīng)的Km值。

1.2.5 制備復(fù)方利福昔明納米乳：根據(jù)納米乳的載藥量、穩(wěn)定性及偽三元相圖的乳區(qū)面積，確定復(fù)方利福昔明納米乳的最佳配方。室溫下，稱取利福昔明、油相、助表面活性劑、表面活性劑，充分攪拌混勻，緩慢滴加配方量的蒸餾水，不斷攪拌，即可制備澄清、透明的復(fù)方利福昔明納米乳。

1.3 復(fù)方利福昔明納米乳的質(zhì)量評價

1.3.1 離心試驗：量取10 mL復(fù)方利福昔明納米乳于離心管中，3 750 r/min離心5 h（相當于自然放置1年）。取出乳液，觀察其外觀狀態(tài)。

1.3.2 類型鑒定：取同批次等量復(fù)方利福昔明納米乳于2個西林瓶中，一個加入少量的紅色染料蘇丹紅Ⅲ溶液（用肉豆蔻酸異丙酯溶解），另一個加入少量藍色染料亞甲基藍溶液，觀察納米乳中不同染料的擴散速度。若納米乳中紅色染料的擴散速度比藍色染料的擴散速度快，則納米乳為油包水型（W/O型）；相反則為水包油型（O/W型）；擴散速度相同則為雙連續(xù)型（W/O/W或O/W/O）。

1.3.3 穩(wěn)定性測試

1.3.3.1 溫度試驗：將復(fù)方利福昔明納米乳裝入潔凈的西林瓶中， 分別于-20、0、4、25、37、60 ℃條件下放置15 d，并在第5、10、15天觀察樣品有無變化。

1.3.3.2 光照試驗：將復(fù)方利福昔明納米乳裝入潔凈的西林瓶中，分別在光照強度為1 000～2 000 lx的條件下，觀察樣品有無變化。

1.3.3.3 長期試驗：取3個批次制備的復(fù)方利福昔明納米乳于10 mL離心管中，置于溫度（25±2）℃、相對濕度（60±10）%的環(huán)境中儲存12個月，分別于第 0、3、6、9、12 個月觀察樣品有無變化。

1.3.4 微觀形態(tài)觀察：取適量復(fù)方利福昔明納米乳，用蒸餾水稀釋5倍，滴加幾滴覆蓋在透射電子顯微鏡的銅網(wǎng)上，用質(zhì)量分數(shù)為2.0%的磷鎢酸負染30 s，自然晾干，于透射電子顯微鏡下觀察復(fù)方利福昔明納米乳的微觀形態(tài)。

1.3.5 粒徑分布：取復(fù)方利福昔明納米乳適量，用蒸餾水稀釋5倍，利用激光粒度分析儀測定該納米乳的平均粒徑。

圖1 不同表面活性劑對納米乳制備的影響

圖2 不同Km值對納米乳制備的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方利福昔明納米乳的配方篩選與制備

2.1.1 篩選油相：利福昔明在丁香酚、香芹酚、肉桂醛、杉木油中的溶解度分別是0.24、0.05、0.25、0.10 g/g，其在肉桂醛中的溶解度最大，因此，選擇肉桂醛為油相。

2.1.2 篩選表面活性劑：當以肉桂醛為油相時，使用Tween-80無法形成澄清、透明的液體，偽三元相圖中無乳區(qū)；以EL-40、RH-40為表面活性劑時，可以形成澄清、透明的液體，其偽三元相圖見圖1。圖1-1的偽三元相圖中陰影面積最大，因此，選擇EL-40為表面活性劑。

2.1.3 篩選助表面活性劑：利福昔明在乙醇、PEG-200、PEG-400中的溶解度分別是 0.05、0.20、0.02 g/g，其在 PEG-200中的溶解度最大，因此，選擇PEG-200為助表面活性劑。

2.1.4 確定Km值：不同Km值繪制的偽三元相圖見圖2。圖2-2的陰影部分面積最大，因此，確定表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比為4∶1。

2.1.5 制備復(fù)方利福昔明納米乳：綜合考慮納米乳的載藥量、穩(wěn)定性等因素，確定復(fù)方利福昔明納米乳的最佳配方為：利福昔明1%、肉桂醛2.44%、PEG-200 4.88%、EL-40 19.51%、蒸餾水72.17%。

2.2 復(fù)方利福昔明納米乳的質(zhì)量評價

2.2.1 離心試驗：經(jīng)過離心后復(fù)方利福昔明納米乳仍保持澄清、透明，未出現(xiàn)分層、破乳、沉淀等現(xiàn)象。

2.2.2 類型鑒定：經(jīng)染料擴散試驗，藍色染料亞甲基藍較紅色染料蘇丹紅Ⅲ溶液在液體中的擴散速度快，表明復(fù)方利福昔明納米乳為水包油型（O/W）納米乳。

2.2.3 穩(wěn)定性測試

2.2.3.1 溫度試驗：復(fù)方利福昔明納米乳在不同溫度、不同時間均澄清、透明，未出現(xiàn)分層、破乳、沉淀等現(xiàn)象。

2.2.3.2 光照試驗：復(fù)方利福昔明納米乳在不同光照強度下，外觀未發(fā)生變化。

2.2.3.3 長期試驗：復(fù)方利福昔明納米乳分別放置 0、3、6、9、12 個月，仍澄清、透明，未出現(xiàn)分層、沉淀、破乳等現(xiàn)象。

2.2.4 微觀形態(tài)觀察：經(jīng)透射電子顯微鏡放大30 000倍觀察，復(fù)方利福昔明納米乳的乳滴呈圓球形，大小均一，均勻分散，無粘連（見圖3）。

圖3 復(fù)方利福昔明納米乳的透射電鏡圖片（30 000×）

2.2.5 粒徑分布：復(fù)方利福昔明納米乳的平均粒徑小、粒徑分布范圍較窄，粒徑介于1～30 nm（見圖 4）。

圖4 復(fù)方利福昔明納米乳的粒徑分布

3 討論

利福昔明是一種抗菌譜廣、殺菌能力強的利福霉素類抗生素，其在腸道內(nèi)的濃度較高，在治療腸道感染、肝性腦病、小腸內(nèi)細菌過度生長、結(jié)腸憩室等疾病時，取得了良好的效果［4-5］。袁喆等［1］對利福昔明的藥代動力學(xué)進行了研究，發(fā)現(xiàn)其難溶于水，口服很難被吸收。肉桂醛具有較強的抑菌活性，對多種細菌具有抗菌作用，不易產(chǎn)生耐藥性，是一種高效的天然抗菌劑［6］。肉桂醛還可阻止消化酶對胃腸道黏膜的侵蝕作用，加快消化道黏膜的血液循環(huán)，防止消化道潰瘍，增強胃腸道蠕動［7-9］。該研究將利福昔明與肉桂醛聯(lián)合用藥，制備成復(fù)方利福昔明納米乳，可以增加藥物吸收，減少抗生素的用藥量，同時納米乳易溶于水的特性方便畜禽給藥。

納米乳作為一種新型納米載藥系統(tǒng)，可改變難溶性藥物臨床應(yīng)用劑型較少的現(xiàn)狀，提高藥物生物利用度，減少用藥量，降低藥物的不良反應(yīng)。納米乳制備過程中配方篩選至關(guān)重要，其中油相、表面活性劑的選擇直接決定著納米乳制備的成敗。選擇油相時應(yīng)綜合考慮毒性、穩(wěn)定性、對藥物的溶解性、成本等因素。復(fù)方利福昔明納米乳選擇肉桂醛作為油相，可最大限度溶解藥物，同時由于肉桂醛具有廣泛的抑菌作用，與利福昔明聯(lián)合應(yīng)用可提高抗菌作用，減少用藥量，降低成本。選擇表面活性劑時，毒性、使用量、成本等均應(yīng)考查清楚。復(fù)方利福昔明納米乳選擇EL-40為表面活性劑，其安全、性質(zhì)穩(wěn)定，偽三元相圖中形成的乳區(qū)面積最大，使用量低。納米乳中加入助表面活性劑，不僅能提高載藥量，同時可減少表面活性劑的使用量，降低表面活性劑的刺激性，提高制劑穩(wěn)定性。復(fù)方利福昔明納米乳選擇PEG-200為助表面活性劑，進一步增加了納米乳中藥物的含量，減少了給藥劑量。該研究制備的復(fù)方利福昔明納米乳澄清、透明，粒徑分布均勻，性質(zhì)穩(wěn)定，方便給藥，有望應(yīng)用于臨床治療畜禽腸道細菌感染性疾病。

參考文獻：

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