半乳糖凝集素3調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

王永強(qiáng)，劉子厚，舒 杰，湯參娥，羅凡硯

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1心胸外科 2醫(yī)學(xué)研究中心，長沙 410008

ActaAcadMedSin，2018,40(2)：219-224

肺癌是發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康。美國癌癥協(xié)會(huì)根據(jù)流行病學(xué)資料預(yù)測，2017年美國新發(fā)肺癌約222 500例，估計(jì)155 870例因?yàn)榉伟┒劳鯷1]。在肺癌中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一[2]，轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)是誘導(dǎo)肺癌發(fā)生EMT的重要細(xì)胞因子，能增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[3]。半乳糖凝集素3是半乳糖凝集素家族中的一員，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)程和疾病轉(zhuǎn)歸[4- 5]。目前半乳糖凝集素3參與肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化研究的報(bào)道較少。本研究主要探討半乳糖凝集素3對(duì)肺癌A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心細(xì)胞庫，使用含10%的胎牛血清和1%青霉素—鏈霉素的RPIM- 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞置于37℃(5% CO2，95%空氣)培養(yǎng)箱中生長。對(duì)照組為轉(zhuǎn)染空載體腺病毒的A549，實(shí)驗(yàn)組包括過表達(dá)半乳糖凝集素3的A549、空載體組加入TGF-β處理和過表達(dá)組的A549加入TGF-β處理。其中TGF-β的處理濃度為20 μmol/L，加入時(shí)間為轉(zhuǎn)染后48 h，處理時(shí)間為24 h。

病毒轉(zhuǎn)染利用人類血清型5型腺病毒，將目的基因半乳糖凝集素3和PENTER-C-Flag載體轉(zhuǎn)入肺癌A549細(xì)胞中，腺病毒載體由維真生物構(gòu)建。對(duì)照組使用腺病毒空載體轉(zhuǎn)染。將肺癌A549細(xì)胞種植于6孔板中，待6孔板細(xì)胞密度達(dá)到70%，加入構(gòu)建好的腺病毒，每孔腺病毒數(shù)目為5×108個(gè)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以保證轉(zhuǎn)染效率。48 h后Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。

Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)利用蛋白印記技術(shù)檢測目的蛋白及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將干預(yù)好的A549細(xì)胞使用PBS洗滌3次，使用含有1%磷酸酶抑制劑的蛋白酶抑制劑和1%蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟的強(qiáng)效蛋白裂解液體(碧云天生物技術(shù)，中國)提取總蛋白。蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)，中國)測定蛋白濃度。每個(gè)樣本取35 μg蛋白上樣，使用10%的SDS-PAGE 膠分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二乙烯膜(Millipore，IPVH00010)上，5%脫脂奶粉封閉2 h，半乳糖凝集素3(1∶1000，艾博抗公司)、鈣黏附蛋白E(1∶1000，細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司)、波形蛋白(1∶1000，細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司)等一抗4℃過夜。辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶3000)常溫孵育2 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，中國)檢測細(xì)胞活性，繪制增殖曲線。各分組細(xì)胞干預(yù)后，以500個(gè)/孔種于96孔板，過夜培養(yǎng)；更換培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)和培養(yǎng)基以1∶10加入每孔中，37℃孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。分別檢測干預(yù)0、24、48、72、96 h的光密度(optical density，OD)值，并繪制增殖曲線。

免疫熒光檢測相關(guān)蛋白表達(dá)利用抗原抗體特異結(jié)合檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)和分布。各分組細(xì)胞干預(yù)后，以103個(gè)/孔種于96孔板，過夜培養(yǎng)。更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后PBS漂洗，4%多聚甲醛固定15 min，山羊血清封閉1 h，鈣黏附蛋白E (1∶100)和 半乳糖凝集素3 (1∶200)一抗4℃過夜，cy3熒光二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，4’，6-二脒基- 2-苯基吲哚染細(xì)胞核，免疫熒光成像(PerkinElmer成像系統(tǒng))。

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)利用機(jī)械手段檢測肺癌A549細(xì)胞的遷移能力。各分組細(xì)胞干預(yù)后，以106個(gè)/孔種于6孔板，過夜培養(yǎng)。更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%，使用200 μl的移液槍吸頭在6孔板中劃痕，低血清連續(xù)培養(yǎng)48 h，顯微鏡下記錄細(xì)胞劃痕愈合距離和時(shí)間。

細(xì)胞侵襲性實(shí)驗(yàn)通過肺癌細(xì)胞A549消化基質(zhì)膠穿過小室的細(xì)胞數(shù)目檢測腫瘤細(xì)胞侵襲能力。各分組細(xì)胞干預(yù)后，以5×103個(gè)/孔種于穿透小室(康寧公司，美國)上室，上室加入含1% 胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl，下室加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基750 μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。去除培養(yǎng)基，擦除上室細(xì)胞，無水甲醇固定10 min，0.5%的結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察記錄穿過小室的細(xì)胞數(shù)目。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

半乳糖凝集素3過表達(dá)后對(duì)細(xì)胞形態(tài)和EMT相關(guān)蛋白的影響A549經(jīng)過腺病毒處理后48 h，使用Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測相關(guān)基因的表達(dá)狀況。與對(duì)照組相比，過表達(dá)組的A549中半乳糖凝集素3蛋白表達(dá)水平明顯上升，因?yàn)橄俨《据d體中加入了Flag標(biāo)簽蛋白，故相對(duì)分子量較大，出現(xiàn)雙條帶，達(dá)到了在A549中過表達(dá)半乳糖凝集素3的目的(圖1A、1B)。免疫熒光圖可見過表達(dá)半乳糖凝集素3對(duì)A549的細(xì)胞形態(tài)無影響(圖1A)，半乳糖凝集素3在細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核中均有表達(dá)。EMT相關(guān)蛋白鈣黏附蛋白E和波形蛋白的表達(dá)無改變(圖1B)。

半乳糖凝集素3對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞的遷移能力，遷移能力越強(qiáng)，劃痕愈合面積越大。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果以其遷移面積占劃痕總面積(cm2)的百分比表示，過表達(dá)半乳糖凝集素3的A549細(xì)胞與正常對(duì)照組相比，對(duì)照組為(54.8±2.6)%，過表達(dá)組為(51.0±2.7)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.9727，P=0.3858)(圖2A)。鋪好基質(zhì)膠的穿透小室可以用來檢測腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞越多，腫瘤的侵襲能力越強(qiáng)。過表達(dá)半乳糖凝集素3后，相同的細(xì)胞數(shù)，對(duì)照組穿過基質(zhì)膠發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目(268±22.85)個(gè)，過表達(dá)組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目為(180±17.32)個(gè)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.419，P=0.6971)(圖2B、2D)。CCK- 8實(shí)驗(yàn)可以檢測細(xì)胞活性，在5 d的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)后對(duì)照組和過表達(dá)組測得的OD值分別為0.41、1.01、1.35、1.25、1.39、1.45和0.48、1.01、1.27、1.18、1.42、1.47，兩因素重復(fù)測量方差分析顯示，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.64，P=0.4322)(圖2C)。

TGF-β誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞EMT時(shí)，半乳糖凝集素3對(duì)EMT相關(guān)蛋白的影響設(shè)置空載體組和空載體加TGF-β組以驗(yàn)證EMT的發(fā)生?？蛰d體加TGF-β組對(duì)比空載體組，EMT相關(guān)蛋白鈣黏附蛋白E表達(dá)下調(diào)和波形蛋白表達(dá)上調(diào)，TGF-β誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞EMT模型建立成功。對(duì)照組為空載體轉(zhuǎn)染組加入TGF-β誘導(dǎo)EMT，實(shí)驗(yàn)組為過表達(dá)半乳糖凝集素3蛋白組加入TGF-β誘導(dǎo)EMT。對(duì)Western blot條帶進(jìn)行灰度分析和免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)組中半乳糖凝集素3蛋白表達(dá)水平明顯上升(圖3A、3B)。免疫熒光圖可見發(fā)生EMT的A549的細(xì)胞拉伸變長，分散于視野中，其中實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞拉伸變長的數(shù)量顯著高于對(duì)照組(圖3B)，EMT相關(guān)蛋白鈣黏附蛋白E表達(dá)下調(diào)，波形蛋白表達(dá)上調(diào)(圖3A)。

Mr：相對(duì)分子質(zhì)量

Mr：relative molecular mass

A. 免疫熒光檢測結(jié)果(×200)；B.Western blot檢測結(jié)果

A. result of immunofluorescence(×200)；B. result of Western blot

圖1A549細(xì)胞系中過表達(dá)半乳糖凝集素3后相關(guān)蛋白檢測

Fig1Levels of related proteins were analyzed after Galectin3 was over-expressed

OD：光密度

OD：optical density

圖2在A549細(xì)胞系中過表達(dá)半乳糖凝集素3后，細(xì)胞遷移無變化(×100)(A)，細(xì)胞侵襲性無變化(×100)(B)，細(xì)胞增殖無變化(C)，細(xì)胞侵襲性試驗(yàn)顯示侵襲性無差異(D)

Fig2Galectin3 over-expression in A549 cell line resulted in no change in cell migration (×100) (A)，invasion (×100) (B)，or proliferation (C)，and there was no significant change in invasion detected by Transwell counting (D)

TGF-β:轉(zhuǎn)化生長因子-β；aP<0.0001；bP<0.0001；cP=0.0119

TGF-β：transforming growth factor-β;aP<0.0001;bP<0.0001;cP=0.0119

A.Western blot檢測蛋白表達(dá)鈣黏附蛋白E降低，波形蛋白表達(dá)升高；B.免疫熒光檢測實(shí)驗(yàn)組鈣黏附蛋白E降低，向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化數(shù)目增多(×200)

A.the expression of E-cadherin was down-regulated and the expression of vimentin was up-regulated when measured by Western blot；B. E-cadherin expression was down-regulated in experimental group，as detected by immunofluorescence (×200)，along with increased epithelial-mesenchymal transition

圖3TGF-β誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)，半乳糖凝集素3過表達(dá)的A549細(xì)胞系鈣黏附蛋白E表達(dá)降低

Fig3Galectin3 promoted TGF-β-induced A549 epithelial-mesenchymal cell transformation，and E-cadherin was down-regulated in Galectin3-over-expressed A549

TGF-β誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞EMT時(shí)，半乳糖凝集素3對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞的遷移能力，對(duì)照組遷移面積是劃痕的(44.4±3.8)%，半乳糖凝集素3過表達(dá)組遷移面積是劃痕的(76.6±5.6)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.739，P=0.0090)(圖4A)。穿透小室用來檢測腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，對(duì)照組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目為(101±9)個(gè)，過表達(dá)組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目是(139±6)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.161，P=0.0067)(圖4B、4D)。CCK- 8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性，對(duì)照組和過表達(dá)組測得的OD值分別為0.18、1.04、1.18、1.40、1.45和0.21、1.02、1.20、1.47、1.49，兩因素重復(fù)測量方差分析顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.31，P=0.5837)(圖4C)。

討 論

肺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康，其相關(guān)分子機(jī)制的研究具有重要的臨床意義。半乳糖凝集素3廣泛存在于各種組織和器官中，具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用[6]。多項(xiàng)研究顯示半乳糖凝集素3在肺癌中高表達(dá)[7- 8]，但半乳糖凝集素3調(diào)控肺癌的相關(guān)機(jī)制研究較少。因此，本研究在肺癌A549細(xì)胞系中使用腺病毒載體系統(tǒng)過表達(dá)半乳糖凝集素3，并檢測過表達(dá)半乳糖凝集素3后A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示過表達(dá)半乳糖凝集素3對(duì)細(xì)胞的形態(tài)功能無影響，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力無變化，EMT相關(guān)蛋白鈣黏附蛋白E和波形蛋白表達(dá)無變化，表明肺癌細(xì)胞A549中高表達(dá)的半乳糖凝集素3對(duì)肺癌細(xì)胞的功能無直接影響。有研究顯示半乳糖凝集素3和β-鏈蛋白相結(jié)合是參與腫瘤功能調(diào)解的重要機(jī)制[9]，在肺癌中，半乳糖凝集素3高表達(dá)，可以與游離的β-鏈蛋白相結(jié)合，使游離的β-鏈蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)水平較低，進(jìn)一步過表達(dá)半乳糖凝集素3，可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能無影響。

EMT是細(xì)胞失去細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附、極性和黏附分子并向間葉細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變，獲得間葉細(xì)胞的功能[10- 11]。EMT是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的重要因素之一[12]。在肺癌A549細(xì)胞中，TGF-β可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲[13]。由此可見，TGF-β誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT是肺癌發(fā)展的重要生物學(xué)機(jī)制之一[14]，在TGF-β誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞EMT的模型下研究半乳糖凝集素3的生物學(xué)功能很有必要。TGF-β誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，過表達(dá)半乳糖凝集素3的A549細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化的數(shù)目和比例較對(duì)照組增多，EMT相關(guān)蛋白鈣黏附蛋白E表達(dá)下調(diào)，波形蛋白表達(dá)上調(diào)，表明半乳糖凝集素3促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)肺癌A549發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。相應(yīng)地，過表達(dá)組腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力均較對(duì)照組增強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞的增殖能力未發(fā)生變化，進(jìn)一步證實(shí)半乳糖凝集素3在肺癌中的作用和TGF-β作用密切相關(guān)。相關(guān)研究顯示，在結(jié)腸癌、胰腺癌和壺腹周圍癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中，半乳糖凝集素3表達(dá)升高，鈣黏附蛋白E表達(dá)降低[15- 16]；Shimura等[17]提出鈣黏附蛋白E和半乳糖凝集素3之間的調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)胞表面鈣黏附蛋白E減少，會(huì)使與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合的β-鏈蛋白游離，游離的β-鏈蛋白與半乳糖凝集素3結(jié)合形成復(fù)合體，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞遷移能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。本研究明確了半乳糖凝集素3可以促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞EMT，但未能進(jìn)一步揭示相關(guān)的分子機(jī)制，是細(xì)胞膜上的半乳糖凝集素3發(fā)揮作用還是細(xì)胞內(nèi)的半乳糖凝集素3發(fā)揮作用，還是同時(shí)發(fā)揮作用，這些調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

aP=0.0067

A.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)(×100)表明過表達(dá)組遷移能力加強(qiáng)；B.細(xì)胞侵襲性實(shí)驗(yàn)(×100)表明過表達(dá)組侵襲性加強(qiáng)；C.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力無變化；D.細(xì)胞侵襲性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示過表達(dá)組侵襲性加強(qiáng)

A. wound healing assay (×100) suggested enhanced migration ability in over-expressed group；B. transwell assay (×100) indicated improved invasion in over-expressed group；C. cell proliferation test revealed no change in cell proliferation ability in over-expressed group；D. transwell counting suggested improved invasion in over-expressed group

圖4TGF-β誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)，半乳糖凝集素3過表達(dá)的A549細(xì)胞系細(xì)胞增殖能力無變化，細(xì)胞遷移能力和侵襲能力加強(qiáng)

Fig4When Galectin3 promoted TGF-β-induced A549 epithelial-mesenchymal cell transformation，the cellular migration and invasion abilities were enhanced and the proliferation ability was not changed

綜上，本研究表明，半乳糖凝集素3在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。半乳糖凝集素3有促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)肺癌EMT的作用，可以間接增強(qiáng)腫瘤的遷移和侵襲能力，為肺癌的研究提供了新方向，針對(duì)半乳糖凝集素3的研究可能為肺癌的治療提供新的線索。

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