谷氨酰胺聯(lián)合吉西他濱對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡及XIAP表達(dá)的影響

饒顯浪，鄧述愷（西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，四川瀘州646000）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，腺癌是其最主要的組織學(xué)類型，吉西他濱主要用于非小細(xì)胞肺癌一線化療及維持治療用藥。近年來，相關(guān)研究表明，谷氨酰胺具有一定的抗腫瘤作用，谷氨酰胺聯(lián)合化療可增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。有研究表明，X?連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的作用[1]。本研究探討了體外谷氨酰胺聯(lián)合吉西他濱對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡及對(duì)XIAP表達(dá)的影響，旨在為肺癌化療提供更有效的方案及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺腺癌A549細(xì)胞株為西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科贈(zèng)送，吉西他濱購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：150804），谷氨酰胺、胚牛血清、胰酶、CCK?8試劑盒均購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司，達(dá)爾伯克孜良伊格爾哈姆F?12培養(yǎng)基（DMEM/F?12）購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白 V?異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V?FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自天津三箭生物技術(shù)有限公司，XIAP試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抑制濃度選取 吉西他濱濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及查閱文獻(xiàn)[1?2]得到人非小細(xì)胞肺癌的半數(shù)抑制濃度為0.01 mg/L，選取半數(shù)抑制濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。谷氨酰胺濃度根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取最佳抑制濃度32 mmol/L為實(shí)驗(yàn)濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用含10%胚牛血清、100μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F?12培養(yǎng)液培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞，置于含5%二氧化碳、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)置空白對(duì)照組（無藥物干預(yù)）、吉西他濱組（0.01 mg/L）、谷氨酰胺組（32 mmol/L）、聯(lián)合用藥組[谷氨酰胺（32 mmol/L）聯(lián)合吉西他濱（0.01 mg/L）]，分別培養(yǎng) 24、48、72 h 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長期的人肺腺癌A549細(xì)胞，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔加100 μL，貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，分別加入吉西他濱（0.01 mg/L）、谷氨酰胺（32 mmol/L）及吉西他濱（0.01 mg/L）聯(lián)合谷氨酰胺（32 mmol/L）作用24、48、72 h，每組重復(fù) 5 孔，同時(shí)，設(shè)置對(duì)照組。各孔加入CCK?8試劑盒試劑0.01 mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按公式測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Annexin V?FITC/PI雙染后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)72 h后用胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min。用磷酸鹽緩沖液清洗2次后，用300 μL的結(jié)合緩沖液重懸。加入5 μL Annexin V?FITC，混勻后避光孵育 10 min，加入碘化丙啶 5 μL，混勻后避光孵育5 min，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞中XIAP的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)72 h后收集上清液備用。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔分別加入 0、25、50、100、200、400 pg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL；樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，空白孔不加。標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板后37℃孵育60 min，棄上清液，洗板 5 次；每孔加底物 A、B 各 50 μL，37℃避光孵育15 min，加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測(cè)定各孔吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算XIAP終濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組組間、組內(nèi)比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組人肺腺癌A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖抑制率比較 谷氨酰胺組、吉西他濱組及聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖抑制率均明顯高于空白對(duì)照組，且隨作用時(shí)間的延長抑制作用逐漸增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖抑制率均明顯高于其他各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1、圖 1。

表1 各組人肺腺癌A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖抑制率比較（±s，%）

表1 各組人肺腺癌A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖抑制率比較（±s，%）

注：與空白對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05；與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.05；與谷氨酰胺組同時(shí)間點(diǎn)比較，cP＜0.05；與吉西他濱組同時(shí)間點(diǎn)比較，dP＜0.05

組別空白對(duì)照組吉西他濱組谷氨酰胺組聯(lián)合用藥組24 h 0.000±0.000 34.693±2.075a 28.773±0.468a 54.690±1.510acd 48 h 0.000±0.000 51.806±1.018ab 48.803±0.801ab 71.780±0.318abcd 72 h 0.000±0.000 69.961±0.697ab 66.888±0.376ab 79.664±0.749abcd

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 各組人肺腺癌A549細(xì)胞作用72 h后凋亡率比較空白對(duì)照組人肺腺癌A549細(xì)胞作用72 h后凋亡率為（2.9±0.8）%，吉西他濱組為（53.6±2.0）%，谷氨酰胺組為（37.6±1.7）%，聯(lián)合用藥組為（60.0±0.4）%。與空白對(duì)照組比較，吉西他濱組、谷氨酰胺組、聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細(xì)胞作用72 h后凋亡率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細(xì)胞作用72 h后凋亡率明顯高于吉西他濱組、谷氨酰胺組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 2、3。

圖2 各組人肺腺癌A549細(xì)胞作用72 h后凋亡率比較

圖3 各組人肺腺癌A549細(xì)胞作用72 h后細(xì)胞凋亡圖

2.3 各組人肺腺癌A549細(xì)胞XIAP表達(dá)比較 空白對(duì)照組人肺腺癌A549細(xì)胞XIAP表達(dá)水平為（217.131±7.105）pg/mL，吉西他濱組為（276.972±10.505）pg/mL，谷氨酰胺組為（116.267±8.268）pg/mL，聯(lián)合用藥組為（163.448±5.517）pg/mL。與空白對(duì)照組比較，吉西他濱組人肺腺癌A549細(xì)胞XIAP表達(dá)明顯升高，谷氨酰胺組、聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細(xì)胞XIAP表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組人肺腺癌A549細(xì)胞XIAP表達(dá)比較

3 討 論

肺癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均居癌癥首位，尤以非小細(xì)胞肺癌居多，其中腺癌是肺癌最主要的組織學(xué)類型。目前，化療仍是肺癌的主要治療方法之一。

吉西他濱屬細(xì)胞周期特異性抗代謝藥物，主要作用于DNA合成期，其特點(diǎn)為抗瘤譜廣、不良反應(yīng)少，1996年美國食品藥品監(jiān)督管理局正式批準(zhǔn)吉西他濱作為非小細(xì)胞肺癌的一線化療藥物[3]。但目前肺癌對(duì)吉西他濱存在一定普遍耐藥情況，其臨床應(yīng)用受到一定限制。吉西他濱在體內(nèi)代謝過程復(fù)雜，涉及多種蛋白和因子的參與，其耐藥性的產(chǎn)生也是由多因素共同作用的結(jié)果[4]。因此，尋找有效的藥物增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌對(duì)吉西他濱的敏感性及增強(qiáng)化療療效尤為重要。

谷氨酰胺是一種條件必需氨基酸，是包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的快速生長細(xì)胞的主要能源物質(zhì)。但近年來不少研究表明，谷氨酰胺具有一定的抗腫瘤作用。MAR?TINS等[5]發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠補(bǔ)充谷氨酰胺可抑制腫瘤細(xì)胞生長，減輕惡病質(zhì)，在FRACARO等[6]的研究中也得到證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中補(bǔ)充谷氨酰胺可抑制腫瘤細(xì)胞生長[7]。TODOROVA等[8]發(fā)現(xiàn)，荷瘤動(dòng)物經(jīng)腸補(bǔ)充谷氨酰胺可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可下調(diào)β細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因?2表達(dá)水平，同時(shí)，上調(diào)β細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因?2相關(guān)蛋白 X、凋亡蛋白酶?3（Caspase?3）表達(dá)水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果顯示，谷氨酰胺組人肺腺癌A549細(xì)胞增殖抑制率明顯高于空白對(duì)照組，且隨作用時(shí)間的延長抑制作用也增強(qiáng)；谷氨酰胺組人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡率也明顯高于空白對(duì)照組，提示谷氨酰胺能抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

XIAP是IAPs的成員之一，是凋亡抑制蛋白家族中唯一能直接抑制凋亡蛋白酶的凋亡抑制蛋白，能同時(shí)抑制起始階段及效應(yīng)階段的凋亡蛋白酶，通過抑制啟動(dòng)性Caspase?9在上游阻止Caspase?3的激活，通過抑制效應(yīng)性Caspase?3和Caspase?7而阻止凋亡通路下游途徑，對(duì)凋亡蛋白酶誘發(fā)的外源性及內(nèi)源性細(xì)胞凋亡過程具有明顯的抑制作用，是作用極強(qiáng)的凋亡抑制劑[9?10]。XIAP在許多腫瘤中高表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌，且腫瘤的病理分期越晚，組織學(xué)分化越差，術(shù)后復(fù)發(fā)率越高，XIAP 表達(dá)量越高[11?12]。XIAP 參與了化療耐藥，相關(guān)的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)XIAP表達(dá)能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療誘導(dǎo)凋亡的敏感性[13]。

近年來，不少研究報(bào)道了吉西他濱能上調(diào)胰腺癌中XIAP的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性降低[14?15]。因此，作者猜想，吉西他濱能上調(diào)肺癌XIAP的表達(dá)，谷氨酰胺能下調(diào)XIAP的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，吉西他濱能上調(diào)XIAP的表達(dá)，谷氨酰胺、吉西他濱聯(lián)合谷氨酰胺均能降低XIAP的表達(dá)，且聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率均高于吉西他濱組和谷氨酰胺組，表明谷氨酰胺能增強(qiáng)吉西他濱的抗腫瘤作用。

綜上所述，谷氨酰胺能抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，聯(lián)用吉西他濱時(shí)能明顯增強(qiáng)吉西他濱對(duì)

人肺腺癌細(xì)胞的抑制作用，可能與通過下調(diào)XIAP表達(dá)從而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性有關(guān)，但其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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