神經(jīng)干細(xì)胞提取與培養(yǎng)方法的比較研究

吳 增，李 媛，靳曉飛，周曉紅，高維娟

(1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫(yī)學(xué)院河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是指一類(lèi)具有向多個(gè)細(xì)胞系分化(神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞)，同時(shí)又能自我更新的細(xì)胞。在神經(jīng)組織損傷后，處于靜止?fàn)顟B(tài)的NSCs可被激活、增殖，并可遷移至損傷區(qū)，取代受損的細(xì)胞，并重建神經(jīng)環(huán)路來(lái)修復(fù)受損的神經(jīng)組織。但內(nèi)源性NSCs數(shù)量不多，而且能遷移到損傷區(qū)的內(nèi)源性NSCs的數(shù)量有限[1]，所以積極開(kāi)展外源性NSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[2]。目前，外源性NSCs提取和體外培養(yǎng)方法均有多種，得到活力和穩(wěn)定性均較高的NSCs種子細(xì)胞效果不一。因此，比較、篩選、建立一套完善、實(shí)用、可靠的NSCs提取、體外培養(yǎng)方法，為獲得外源性NSCs提供良好的技術(shù)支持，是本研究的目的所在。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康SD孕鼠、乳鼠。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0011。

1.2試劑DMEM/F12(1 ∶1)、B-27、Accutase酶均購(gòu)于Gibco公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)購(gòu)于PeproTech公司；胎牛血清購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司；巢蛋白(Nestin)抗體、Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG，購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；T1350型胰蛋白酶、多聚賴(lài)氨酸，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒，購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.3儀器3111型二氧化碳培養(yǎng)箱、Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀，購(gòu)于Thermo；DM5000B型熒光顯微鏡，購(gòu)于Leica；IX73型生物顯微鏡，購(gòu)于OLYMPUS；80-2型離心機(jī)，購(gòu)于江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

2 方法

2.1NSCs的提取NSCs的來(lái)源分為2組：胎齡14 d胎鼠和新生24 h內(nèi)乳鼠，提取步驟：取孕14 d SD大鼠1只，腹腔注射10%的水合氯醛(3.5 mL·kg-1)，將其浸泡于75%乙醇中30 min(僅露出頭部)，然后用無(wú)菌器械取出子宮，置于75%乙醇中浸泡2 min。在超凈臺(tái)內(nèi)解剖子宮，將胎盤(pán)包裹的胎鼠置于預(yù)冷的D-Hank’s液中。逐個(gè)取出胎鼠的大腦皮質(zhì)，置于含有D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中，迅速用無(wú)菌鑷子仔細(xì)剝離腦膜，將剝離干凈的腦組織轉(zhuǎn)移至含有DMEM/F12(1 ∶1)培養(yǎng)基的平皿中，眼科剪剪碎，用無(wú)菌吸管轉(zhuǎn)移到15 mL離心管內(nèi)，輕柔吹打至肉眼無(wú)可見(jiàn)組織塊為宜，以1000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入NSCs無(wú)血清培養(yǎng)基，輕柔吹打成細(xì)胞懸液，先后過(guò)200目和500目細(xì)胞篩[3-5]。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整濃度為1.0×109·L-1，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。新生24 h內(nèi)乳鼠大腦皮質(zhì)NSCs提取同胎鼠NSCs提取法。原代培養(yǎng)4 d，觀察兩組神經(jīng)球生成情況。

2.2NSCs的的培養(yǎng)

2.2.1培養(yǎng)基 培養(yǎng)基分為2組：A組：DMEM/F12[6](97%)+B27[7](2%)+bFGF(20 μg·L-1)+EGF[8](20 μg·L-1)+青鏈霉素(1%)配制成的NSCs無(wú)血清培養(yǎng)基；B組：DMEM/F12(90%)+胎牛血清(10%)配制成的NSCs含血清培養(yǎng)基。提取胎齡14 d胎鼠大腦皮質(zhì)的NSCs，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×109·L-1，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，懸浮培養(yǎng)法原代培養(yǎng)4 d，觀察兩組神經(jīng)球生成情況。

2.2.2接種 按細(xì)胞接種密度不同，分為3組：1.0×108·L-1組[9]、1.0×109·L-1組[4]和1.0×1010·L-1組。提取胎齡14 d胎鼠大腦皮質(zhì)的NSCs后，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，采用無(wú)血清培養(yǎng)基，采取懸浮培養(yǎng)法，原代培養(yǎng)2、5 d，觀察各組形成神經(jīng)球數(shù)量和狀態(tài)。

2.2.3培養(yǎng)方法 按NSCs培養(yǎng)方法，分為懸浮培養(yǎng)法和貼壁培養(yǎng)法2組。懸浮培養(yǎng)法：將提取的NSCs接種于培養(yǎng)瓶后，不做特殊處理；貼壁培養(yǎng)法：用濃度為0.01%的多聚賴(lài)氨酸包被25 cm2的培養(yǎng)瓶，并將培養(yǎng)瓶置于無(wú)菌環(huán)境中，室溫下過(guò)夜干燥待用。提取胎齡14 d胎鼠大腦皮質(zhì)的NSCs，采用無(wú)血清培養(yǎng)基，以1.0×109·L-1的密度接種，原代培養(yǎng)3 d，觀察兩組神經(jīng)球的形成情況。

2.2.4換液方法 提取胎齡14 d胎鼠大腦皮質(zhì)的NSCs，采用無(wú)血清培養(yǎng)基，以1.0×109·L-1的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，采用懸浮培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，按照換液方法的不同分為3組：每2～3 d全量換液組、每2～3 d半量換液組[4]、每2～3 d不棄液只加液1～1.5 mL組，原代培養(yǎng)7 d，觀察各組所形成的神經(jīng)球活力的差異。

2.2.5傳代方法 按NSCs傳代方法不同，分為3組：胰酶消化組[10-11]、Accutase酶消化組[12]和機(jī)械吹打組[13-14]。酶消化法操作步驟：無(wú)菌吸管將含有神經(jīng)球的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，靜置15 min，去除上清液，加入1 mL 0.125%的胰酶或1 mL Accutase酶，并輕柔緩慢吹打10 min，加入4 mL無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，以1 500 r·min-1離心10 min，去除上清液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×109·L-1，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。機(jī)械吹打法操作步驟：無(wú)菌吸管將含有神經(jīng)球的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，靜置15 min，去除上清液，加入2 mL 無(wú)血清培養(yǎng)基，輕柔緩慢吹打10 min，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×109·L-1，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。比較采用以上3種不同傳代方法傳代后的NSCs狀態(tài)。

2.3NSCs的鑒定將Nestin作為NSCs鑒定的依據(jù)，對(duì)培養(yǎng)至3、5、7代的神經(jīng)球行Nestin免疫熒光染色。鑒定步驟：吸取適量含有神經(jīng)球的培養(yǎng)基，接種于有多聚賴(lài)氨酸包被蓋玻片的12孔板內(nèi)，培養(yǎng)4 h后，顯微鏡下觀察神經(jīng)球已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)，PBS洗3次，每次5 min，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，加0.3% Trition-100室溫下孵育20 min，PBS洗3次，每次5 min，用山羊血清封閉液室溫下封閉30 min，吸除封閉液，滴加一抗(PBS稀釋的效價(jià)為1 ∶100兔抗鼠Nestin抗體)4°C孵育過(guò)夜，PBS洗3次，每次5 min，滴加二抗(Cy3標(biāo)記的山羊抗兔 IgG)室溫避光孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min，用抗熒光衰減封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.4NSCs活性的檢測(cè)按鼠齡的不同和傳代方法的不同，分為4組：24 h乳鼠胰酶消化組、24 h乳鼠Accutase酶消化組、14 d胎鼠胰酶消化組、14 d胎鼠Accutase酶消化組。按本文方法，分別提取新生24 h內(nèi)乳鼠和胎齡14 d胎鼠大腦皮質(zhì)的NSCs，采用無(wú)血清培養(yǎng)基，以1.0×109·L-1的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，采取懸浮培養(yǎng)法，每2～3 d加液1～1.5 mL，每6～7 d傳代1次，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第2代d 7，用無(wú)菌吸管將含有神經(jīng)球的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，靜置15 min，去除上清液，分別加入0.125%胰酶1 mL或Accutase酶1 mL，并輕柔緩慢吹打10 min左右，加入4 mL無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，以1 500 r·min-1離心10 min，去除上清液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×108·L-1，分別接種于96孔板內(nèi)，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，再向細(xì)胞懸液中加入10 μL CCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。吸光度越高，代表NSCs活性越好。

3 結(jié)果

3.1不同鼠齡大腦皮層提取的NSCs比較胎齡14 d胎鼠和新生24 h內(nèi)乳鼠大腦皮質(zhì)均可提取到大量的NSCs。原代培養(yǎng)4 d，觀察兩組均形成了懸浮的狀態(tài)良好的神經(jīng)球，但胎鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)的雜細(xì)胞較乳鼠少(Fig 1)。

3.2不同培養(yǎng)基對(duì)神經(jīng)球的影響采用無(wú)血清培養(yǎng)基組，原代培養(yǎng)4 d，觀察形成了狀態(tài)良好的神經(jīng)球；采用含血清培基組，原代培養(yǎng)4 d，觀察NSCs大部分貼壁分化(Fig 2)。

3.3不同接種密度對(duì)神經(jīng)球的影響接種密度為1.0×108·L-1的NSCs，培養(yǎng)2 d形成極少量神經(jīng)球，培養(yǎng)5 d神經(jīng)球數(shù)量增多，但在3組中神經(jīng)球數(shù)量最少，神經(jīng)球狀態(tài)良好；接種密度為1.0×109·L-1的NSCs，培養(yǎng)2 d形成少量神經(jīng)球，培養(yǎng)5 d神經(jīng)球數(shù)量明顯增多，且狀態(tài)良好；密度為1.0×1010·L-1的NSCs，培養(yǎng)2 d形成大量神經(jīng)球，培養(yǎng)5 d神經(jīng)球解體，且有大量細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，在3組中神經(jīng)球數(shù)量最多(Fig 3)。

Fig 1 Comparison of formation of 4 d neurospheres between fetal rats and neonatal rats

A: The neurospheres formed by 4 d in fetal rats (×100); B: The neurospheres formed by 4 d in fetal rats (×400); C: The neurospheres formed by 4 d in neonatal rats (×100); D: The neurospheres formed by 4 d in neonatal rats (×400).

Fig 2 Comparison of formation of 4 d neurospheres by using different types of culture medium(×100)

A: Primary culture of serum-free medium for 4 d; B: Primary culture of containing serum medium for 4 d.

3.4不同培養(yǎng)方法對(duì)神經(jīng)球的影響懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)3 d，原代NSCs可形成穩(wěn)定的神經(jīng)球，且未出現(xiàn)分化；貼壁培養(yǎng)法的原代NSCs增殖緩慢，培養(yǎng)3 d可見(jiàn)大量細(xì)胞分化(Fig 4)。

3.5不同換液方法對(duì)神經(jīng)球的影響原代培養(yǎng)7 d觀察，全量換液組形成的神經(jīng)球透光性差，神經(jīng)球邊緣有少量死細(xì)胞，神經(jīng)球活力低；半量換液組和只加液不棄液組形成的神經(jīng)球透光均勻，神經(jīng)球活力均較高(Fig 5)。

3.6不同傳代方法對(duì)神經(jīng)球的影響原代和1代的神經(jīng)球：采用機(jī)械吹打法即可將神經(jīng)球分離成單細(xì)胞懸液，活細(xì)胞比例高，再次成球率高，并可以保持穩(wěn)定的未分化狀態(tài)，且較胰酶和Accutase酶消化法方便。2代及以后神經(jīng)球：采用機(jī)械吹打法不能使其完全分離為單細(xì)胞；采用胰酶消化法傳代后，活細(xì)胞比例相對(duì)較低，成球率較低；采用Accutase酶消化法，對(duì)細(xì)胞損傷小，活細(xì)胞比例較高，成球率較高，神經(jīng)球狀態(tài)良好(Fig 6)。

3.7NSCs的鑒定結(jié)果對(duì)培養(yǎng)至3、5、7代的神經(jīng)球行Nestin免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察Cy3標(biāo)記Nestin發(fā)紅光，表明Nestin免疫熒光染色為陽(yáng)性，確定培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs(Fig 7)。

Fig 3 Comparison of formation of 5 d neurospheres by different inoculation densities

A: Inoculation at 1×108·L-1density, primary culture for 5 d (×40); B: Inoculation at 1×108·L-1density, primary culture for 5 d (×400); C: Inoculation at 1×109·L-1density, primary culture for 5 d (×40); D: Inoculation at 1×109·L-1density, primary culture for 5 d (×400); E: Inoculation at 1×1010·L-1density, primary culture for 5 d (×40); F: Inoculation at 1×1010·L-1density, primary culture for 5 d (×400).

Fig 4 Comparison of formation of 3 d neurospheres by using adherent culture method and suspension culture method

A: Primary adherent culture for 3 d (×100); B: Primary adherent culture for 3 d (×400); C: Primary suspension culture for 3 d(×100); D: Primary suspension culture for 3 d (×400).

Fig 5 Comparison of state of primary culture of 7 d neurospheres by different methods of exchange of liquid(×400)

A: Primary culture for 7 d to observe the state of the formation of neurospheres per 2～3 d by all change of culture medium; B: Primary culture for 7 d to observe the state of the formation of neurospheres per 2～3 d by half of change of culture medium; C: Primary culture for 7 d to observe the state of the formation of neurospheres per 2～3 d by only addition of culture medium not discarding culture medium.

Fig 6 Pictures of different generation methods(×400)

A: The picture after the second generation of neurosphere passage by mechanical blow method; B: The picture after the second generation of neurosphere passage by Accutase digestion; C: The picture after the second generation of neurosphere passage by trypsin digestion.

Fig 7 Immunofluorescent staining positive pictures of the 3rd, 5th, 7th generation of neurosphere nestin(×400)

3.8NSCs活性檢測(cè)結(jié)果如Fig 8所示，24 h乳鼠胰酶消化組(0.343±0.056)、24 h乳鼠Accutase酶消化組(0.477±0.045)和14 d胎鼠胰酶消化組(0.468±0.107)的吸光度明顯低于14 d胎鼠Accutase酶消化組(0.625±0.027)，且差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 8 Activity of NSCs

1: 24 h neonatal rat trypsin digestion group; 2: 24 h neonatal rat Accutase digestion group; 3: 14 d fetal rat trypsin digestion group; 4:14 d fetal rat Accutase digestion group.*P<0.05vsgroup 4.

4 討論

經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)反復(fù)摸索后，常規(guī)提取胎齡14 d胎鼠，采用無(wú)血清培養(yǎng)基，以1.0×109·L-1的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，采取懸浮培養(yǎng)法，每2～3 d加液1～1.5 mL，每6～7 d傳代1次(神經(jīng)球直徑為150～250 μm)，所得到的NSCs經(jīng)Nestin免疫熒光染色呈陽(yáng)性，且NSCs增殖分裂旺盛，成球率高，神經(jīng)球狀態(tài)良好，可以保持穩(wěn)定的未分化狀態(tài)。

NSCs所具有的遷移性、分化性、趨化性、低免疫原性等獨(dú)特的生物學(xué)特性，使其成為備受矚目的修復(fù)神經(jīng)損傷的種子細(xì)胞，因此，也打破了成熟神經(jīng)系統(tǒng)不可再生的傳統(tǒng)觀念。目前，NSCs移植已用于各類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的研究，主要用于：① 缺氧缺血性腦損傷，將NSCs移植到缺血缺氧性腦損傷的大鼠腦內(nèi)，可以提高缺血缺氧性大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶能力[15]；② 帕金森病，NSCs移植治療帕金森病在基礎(chǔ)和臨床研究中已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。冷歷歌等[16]臨床研究發(fā)現(xiàn)，帕金森患者經(jīng)NSCs移植治療后，臨床癥狀得到明顯緩解，生活質(zhì)量明顯提高；③ 阿爾茨海默病，大量研究證實(shí)，NSCs移植可以明顯改善阿爾茨海默病鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。目前，關(guān)于NSCs治療人類(lèi)阿爾茨海默病的報(bào)道較少。此外，NSCs移植還在亨廷頓病、腦膠質(zhì)瘤、外周神經(jīng)損傷等疾病中發(fā)揮治療作用。加速體外培養(yǎng)NSCs的增殖，控制其處于未分化狀態(tài)是干細(xì)胞移植的首要前提，但是調(diào)控NSCs增殖、分化和遷移的機(jī)制尚未完全清楚，為了得到純度更高、狀態(tài)更好的NSCs，實(shí)現(xiàn)基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的飛躍，我們不僅需要在培養(yǎng)方法上改進(jìn)，更應(yīng)該對(duì)NSCs的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深層次的研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位老師和同學(xué)的幫助！)

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