抗菌藥物敏感性快速檢測方法研究進(jìn)展

何淵慧(HE Yuan-hui)，奕巧蓮(YI Qiao-lian),杜文斌(DU Wen-bin),鄭 波(ZHENG Bo)

(1 北京大學(xué)第一醫(yī)院 臨床藥理研究所，北京 100034； 2 中國科學(xué)院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101； 3 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)是二十世紀(jì)巨大的醫(yī)學(xué)成就。抗菌藥物的使用大大降低了傳染疾病的病死率，挽救了無數(shù)生命，也使以前的一些絕癥，如結(jié)核病都有了治療的方法。然而最近六十年，我們開始從抗菌藥物的輝煌時(shí)代走向抗菌藥物耐藥性時(shí)代[1]。2014年世界衛(wèi)生組織發(fā)布了全球耐藥報(bào)告[2]，指出抗菌藥物耐藥細(xì)菌正蔓延至全球各地。

細(xì)菌耐藥嚴(yán)重威脅著人類健康，尤其是對于嚴(yán)重感染的患者，急需敏感度、特異度更高和更快速的檢測方法，快速確定是哪種細(xì)菌感染，并分離病原微生物進(jìn)行抗菌藥物敏感試驗(yàn)(antimicrobial susceptibility testing，AST)，以指導(dǎo)臨床選擇抗菌藥物和相應(yīng)劑量。傳統(tǒng)檢測藥敏值的方法有肉湯稀釋法(包括微量肉湯稀釋法與宏量肉湯稀釋法)、瓊脂稀釋法、E-test法及紙片擴(kuò)散法等。宏量肉湯稀釋法過程繁瑣，在不同濃度抗菌藥物溶液制備過程中易出差錯(cuò)；微量肉湯稀釋法的主要缺點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)化的商業(yè)平板中檢測的藥物種類較固定，藥物濃度梯度少，在抗菌藥物折點(diǎn)更新后可能無法覆蓋折點(diǎn)；E-test方法缺點(diǎn)是抗菌藥物品種有限，成本較高，且在檢測聯(lián)合藥敏時(shí)，由于系統(tǒng)誤差，MIC值會較高或較低[3]；此外，傳統(tǒng)方法檢測獲得藥敏結(jié)果常所需時(shí)間較長，易導(dǎo)致漏診、誤診和延誤治療[4-5]。因此，尋求新的快速、準(zhǔn)確的病原菌耐藥檢測技術(shù)是實(shí)現(xiàn)臨床耐藥細(xì)菌感染快速和有效治療的核心，也是突破當(dāng)前抗菌藥物濫用困境的關(guān)鍵。一些新型的藥敏檢測方法在不斷涌現(xiàn)。本綜述將近期基于分子生物學(xué)和適用于現(xiàn)場快速診斷的微型化、便攜化抗菌藥物敏感性快速檢測方法的研究進(jìn)展作系統(tǒng)闡述。

1 自動化檢測儀器

微生物自動鑒定及藥敏測試系統(tǒng)結(jié)合微量快速培養(yǎng)基和微量生化反應(yīng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了藥敏檢測的自動化和機(jī)械化，使得原來緩慢、繁瑣的手工操作變得快速、簡單。典型的產(chǎn)品有法國生物梅里埃公司(BioMérieux)VITEK 2 德靈公司(MicroScan)的Walk Away SI以及BD的PHOENIX等。不同自動化儀器價(jià)格昂貴，通常依賴數(shù)據(jù)庫的更新與補(bǔ)足，方便有余，靈活不足。見表1。

表1 市面常見的微生物自動鑒定及藥敏測試系統(tǒng)

2 基于分子生物學(xué)的藥敏檢測方法

2.1 以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative PCR, qPCR)為基礎(chǔ)的檢測方法 qPCR是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)(染料或探針)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法[6]。qPCR應(yīng)用于AST，主要通過對擴(kuò)增目的基因的定量檢測，反映不同藥物濃度下細(xì)菌的生長情況，以實(shí)現(xiàn)快速檢測。

目的基因的恰當(dāng)選擇對檢測技術(shù)的靈敏度至關(guān)重要，并在一定程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]。Harris等[8]同時(shí)擴(kuò)增pbp2b與lytA基因，快速診斷肺炎鏈球菌感染，發(fā)現(xiàn)其檢測細(xì)菌靈敏性高于同研究中以管家基因16S rRNA為目的基因的qPCR的100倍以上；pbp2b的檢測結(jié)果反映肺炎鏈球菌對青霉素的藥敏。Peuchant等[9]以沙眼衣原體功能不同的omp1、omp2、16S rRNA，以及Hsp60編碼基因groEL1 四種基因作為目的基因監(jiān)測菌體的生長，最終選擇靈敏度高特異性好的omp1作為目的基因，檢測沙眼衣原體對氧氟沙星、莫西沙星、阿奇霉素、多西環(huán)素的藥敏。

在不同的耐藥性檢測中，相同細(xì)菌選擇的目的基因以管家基因16S rRNA居多[7, 10-13]，但也有選擇其他作為目的基因者，如結(jié)核分枝桿菌以特有基因rpoB作為目的基因[13]。檢測不同藥物對幽門螺桿菌的藥敏時(shí)，以23S rRNA、gyrA為目的基因[12, 14]，有研究先用管家基因16S rRNA鑒定細(xì)菌種屬， 再以23S rRNA為目的基因檢測幽門螺桿菌對克拉霉素的藥敏[12]。與檢測耐藥基因反映細(xì)菌的耐藥性不同，Kearns等以青霉素敏感基因pbp2b作為目的基因，反映肺炎鏈球菌對青霉素的AST[15]。

2.2 分子生物學(xué)法定義最低抑菌濃度(MIC)以及檢測MIC的最佳時(shí)間點(diǎn) 不同的研究對MIC的定義不同，檢測MIC的最佳時(shí)間也不同。處于發(fā)展階段的分子生物學(xué)檢測技術(shù)目前無統(tǒng)一指南，需研究者繼續(xù)探索。

Hamasuna等[16]每周一次體外試驗(yàn)檢測尿道支原體，連續(xù)4周監(jiān)測其生長，MIC定義為引起99%抑制率的最低藥物濃度，抑制率 (%) = [(質(zhì)控組中DNA量 -測試組中DNA量)/ 質(zhì)控管組中DNA量]×100%。由于第四周與第三周的MIC值相同，最終選擇第三周作為檢測MIC值的最佳時(shí)間點(diǎn)；Aloni-Grinstein等[17]檢測細(xì)菌1次/h，連續(xù)48 h 監(jiān)測細(xì)菌在不同濃度藥物下的生長，最終選擇細(xì)菌與藥物混合培養(yǎng)的24 h作為MIC值檢測的最佳時(shí)間，MIC 定義為無肉眼可見的細(xì)菌，且能降低細(xì)菌濃度至低于質(zhì)控菌OD630的10%時(shí)的最低藥物濃度。Peuchant等[9]在細(xì)菌與藥物共同培養(yǎng)后的0、3、 6、12、16、 21、25、29、 36、45和53 h分別進(jìn)行檢測，由于檢測細(xì)菌的4種基因在30 h后均處于靜止?fàn)顟B(tài)，因此，以30 h作為讀取MIC值的最佳時(shí)間點(diǎn)，MIC定義為與最初細(xì)菌DNA 濃度有相同值的最低藥物濃度。

2.3 反轉(zhuǎn)錄PCR法 用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測細(xì)菌的耐藥性[18]，相比于以提取的DNA直接作為反應(yīng)模板的熒光定量PCR法，反轉(zhuǎn)錄PCR花費(fèi)時(shí)間長，檢測成本高。Peuchant等[9]用反轉(zhuǎn)錄PCR對mRNA進(jìn)行定量檢測，驗(yàn)證研究中目的基因是否轉(zhuǎn)錄，將MIC定義為能抑制基因轉(zhuǎn)錄的最低藥物濃度qPCR法能快速準(zhǔn)確獲取藥敏結(jié)果，但需更多樣本進(jìn)行驗(yàn)證； 部分PCR或以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法通過檢測耐藥基因反映細(xì)菌藥敏有一定的局限性，畢竟與細(xì)菌表型耐藥有關(guān)又確定的基因有限，而細(xì)菌對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗菌藥物的耐藥又涉及成百上千的基因突變與多種耐藥機(jī)制的表達(dá)，難以通過簡單的基因檢測確定。

3 基于微流控芯片的藥敏檢測新方法

微流控芯片將生化領(lǐng)域中的樣品前處理、檢測等操作，經(jīng)由微納米通道集成到一塊厘米級別的芯片上應(yīng)用于臨床診斷，相對傳統(tǒng)方法更快、更靈敏。在藥敏檢測領(lǐng)域，利用微流控檢測細(xì)菌耐藥性主要有單細(xì)胞檢測，以及與藥敏相關(guān)的生化物質(zhì)檢測。見表2。

表2 基于微流控芯片的藥敏檢測方法

3.1 基于藥敏相關(guān)的生化物質(zhì)檢測藥敏 耐藥菌與敏感菌在抗菌藥物作用下會表現(xiàn)出不同的生化指標(biāo)，利用這些指標(biāo)的不同可區(qū)分耐藥菌與敏感菌。Besant等[19]利用活細(xì)胞和死細(xì)胞指示劑的氧化還原反應(yīng)檢測細(xì)菌的代謝活動，并通過電化學(xué)信號讀取表征細(xì)菌的耐藥情況，減少了預(yù)培養(yǎng)富集的環(huán)節(jié)，1 h內(nèi)即可獲得耐藥表型結(jié)果。Mach等[20]將泌尿道感染采集的尿樣品直接與含抗菌藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)2.5 h后，利用電化學(xué)定量檢測細(xì)菌16S rRNA水平可得到細(xì)菌耐藥表型，從收集尿樣本到獲得檢測結(jié)果僅需3.5 h。Burckhardt等[21]直接利用MALDI-TOF鑒定菌種并檢測NDM-1、VIM-1、VIM-2、KPC-2和不同種類的IMP酶獲得細(xì)菌對碳青霉烯類藥物的耐藥情況，較之傳統(tǒng)的利用光密度檢測方法，質(zhì)譜檢測更精準(zhǔn)并快捷，在1～2.5 h內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果。MALTI-TOF還不能檢測所有與耐藥相關(guān)的蛋白，以上這些方法依賴復(fù)雜的儀器，芯片的制作復(fù)雜，不利于推廣。

3.2 微流控 pH 感應(yīng)器檢測法 監(jiān)測代謝產(chǎn)物可應(yīng)用于細(xì)菌的功能測定[22-23]。在細(xì)菌培養(yǎng)過程中，生長培養(yǎng)基由于葡萄糖或糖代謝產(chǎn)物有機(jī)酸的積累變得酸化，監(jiān)測培養(yǎng)基pH值的變化已成為細(xì)菌功能分析常用方法之一?？咕幬锟梢种萍?xì)菌的生長，降低葡萄糖代謝率。檢測固定在納升孔道中快速積累的細(xì)菌代謝產(chǎn)物，避免了耗時(shí)的預(yù)孵育，從而減少檢測時(shí)間。有效光學(xué)厚度[24]作為光學(xué)信號，可反映由pH值變化引起的殼聚糖水凝膠的溶脹，通過監(jiān)測EOT增加率，確定抗菌藥物對細(xì)菌的抑制作用。

實(shí)驗(yàn)中，每20 min檢測了一次，監(jiān)測時(shí)長約3 h。依據(jù)抑制率定義抗菌活性，抑制率的公式：I =(△EOTblank-△EOTantibiotic)/△EOTblank；公式中△EOTblank和△EOTantibiotic分別代表在該時(shí)期無抗菌藥物樣本和有抗菌藥物樣本EOT的變化。

基于抑制率的MIC檢測方法尚未確定，不同時(shí)期檢測的MIC值大不相同，檢測MIC值的最佳時(shí)間仍在探索中，但最多需要2 h。反應(yīng)中菌液最初濃度與微量肉湯稀釋法的最初濃度5×105CFU/mL一致，而藥物的濃度范圍為包括由美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)指南推薦的用于臨床分離菌中檢測MIC抗菌藥物濃度內(nèi)的連續(xù)5個(gè)2倍稀釋梯度濃度[25]。

微流控pH感應(yīng)器檢測法獲得AST檢測結(jié)果所需時(shí)間短，能在細(xì)菌的代謝水平上檢測細(xì)菌的藥敏值，培養(yǎng)時(shí)間不同，MIC值明顯不同，對MIC值檢測的最佳時(shí)間的確定將是該研究的另一探索。

3.3 微流控檢測細(xì)胞膜機(jī)械壓力 機(jī)械壓力和酶的聯(lián)合作用破壞細(xì)菌的生物膜，藥物能干擾敏感菌修復(fù)生物膜系統(tǒng)，卻不能干擾耐藥菌，熒光標(biāo)記的生物膜以呈現(xiàn)的顏色不同被分為活細(xì)菌與死細(xì)菌，利用該裝置收集的不同熒光信號，以細(xì)菌死亡的速度確定細(xì)菌的表型(易感與抗性)，反映細(xì)菌的藥敏，分別用甲氧西林耐藥、敏感的質(zhì)控菌作為模型，建立檢測體系后，用16株臨床分離金黃色葡萄球菌進(jìn)行驗(yàn)證。

研究中每2 min檢測一次，連續(xù)監(jiān)測60 min，該監(jiān)測提供了定量信息，不需MIC檢測，即可提供一個(gè)客觀的藥敏評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。由于藥液菌液混合培養(yǎng)60 min為細(xì)菌死亡率最高的時(shí)期，該研究以此作為AST檢測的最佳時(shí)間點(diǎn)。經(jīng)驗(yàn)性的以模型細(xì)菌死亡率的0.5%、1%分別作為敏感與中介、中介與耐藥的分界點(diǎn)，以此建立敏感、中介、耐藥的檢測標(biāo)準(zhǔn)，對細(xì)菌的耐藥敏感與否進(jìn)行定性分析。同時(shí)對苯唑西林10、50 mg/L檢測濃度進(jìn)行摸索，由于50 mg/L的檢測結(jié)果更接近以紙片擴(kuò)散法作為對照方法的檢測結(jié)果，被選擇作為細(xì)菌耐藥性的檢測濃度[26]。該方法從表型分析細(xì)菌耐藥性，快速獲得AST檢測結(jié)果。研究著重于機(jī)械力和酶的破壞力[27-28]，經(jīng)驗(yàn)性建立的耐藥、中介、敏感的分界標(biāo)準(zhǔn)，也需進(jìn)一步驗(yàn)證，且不能檢測細(xì)菌對抑菌劑的藥敏狀況。

3.4 單細(xì)胞檢測藥敏 單細(xì)胞檢測可有效避免傳統(tǒng)方法中生長富集的過程。Liu等[29]將待檢菌與含有抗菌藥物的培養(yǎng)基一起包裹在皮升級液滴中共培養(yǎng)，利用耐藥菌增殖改變光學(xué)性質(zhì)，從而篩選出耐藥菌得到藥敏結(jié)果，但該方法存在的問題是每次只能進(jìn)行一種條件的篩選。Choi等[30]在顯微鏡下追蹤單細(xì)菌在抗菌藥物作用下發(fā)生的形態(tài)變化，通過研究細(xì)菌的分裂行為，得到細(xì)菌的耐藥表型，高分辨顯微識別分析圖像需要相應(yīng)的儀器支持，限制了其檢測通量。Baltekin等采用微流控芯片捕獲臨床分離樣本中的細(xì)菌，用顯微鏡觀察多個(gè)單細(xì)菌在不同濃度下的生物反應(yīng)狀況，30 min即可獲得細(xì)菌對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、美西林、多利培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、磷霉素、呋喃妥因、磺胺等臨床治療泌尿系感染常用的9種藥物的藥敏結(jié)果[31]，但該研究檢測對象只有大腸埃希菌，并未涉及腸球菌屬細(xì)菌等其他種類細(xì)菌。Longo等[32]提出了一種基于原子力顯微鏡的檢測方法，在該方法中，懸臂可以在細(xì)菌低濃度的情況下表征細(xì)菌的代謝活動，通過檢測細(xì)胞膜的變化，在十分鐘內(nèi)讀取細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，該方法只能得到粗略的耐藥結(jié)果，且所需儀器操作要求高，不利于推廣。

基于單細(xì)胞的藥敏檢測雖然縮短了單次檢測時(shí)間，但增加了檢測總量，實(shí)際并沒有提高檢測效率。

4 其他快速藥敏檢測方法

4.1 Micromax 試劑盒 原理：研究者利用Micromax 試劑盒，檢測細(xì)菌在含不同濃度藥物的培養(yǎng)基中生長時(shí)DNA的狀況，判斷細(xì)菌對藥物的敏感、中介及耐藥情況。依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)指南，Bou等[33]選擇細(xì)菌敏感、中介、耐藥等4個(gè)藥物折點(diǎn)濃度，將試驗(yàn)菌株分別與不同濃度的藥物在培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)60 min，并對試驗(yàn)細(xì)菌的DNA進(jìn)行染色。細(xì)菌在CLSI定義為敏感濃度的藥物中孵育60 min，DNA出現(xiàn)擴(kuò)散的現(xiàn)象，則該細(xì)菌對該藥物敏感；細(xì)菌在CLSI定義為中介濃度的藥物中孵育60 min，DNA才出現(xiàn)擴(kuò)散的現(xiàn)象，則該細(xì)菌對該藥物為中介；細(xì)菌在CLSI定義為耐藥濃度的藥物中保持完整或者在比耐藥濃度更高濃度的藥物中孵育60 min后DNA才出現(xiàn)擴(kuò)散的現(xiàn)象，則該細(xì)菌對該藥物耐藥。

Bou等先用該方法分別檢測標(biāo)準(zhǔn)菌株對美羅培南、環(huán)丙沙星的藥敏情況，再用322株臨床分離菌株進(jìn)一步驗(yàn)證，以微量肉湯稀釋法和E-test法的檢測結(jié)果作為對照，新方法60 min即可獲得與對照方法完全一致的檢測結(jié)果。雖然在檢測過程中，檢測背景里會出現(xiàn)多余的DNA片段，但由于檢測背景可變，這些片段的量較少，而且只是在與抗菌藥物共同孵育前的培養(yǎng)基中出現(xiàn)，并不會影響檢測結(jié)果的判斷[33]。

該方法準(zhǔn)確快速獲取定性藥敏檢測結(jié)果，未涉及細(xì)菌對抑菌劑的藥敏檢測，但還需要更多種類的抗菌藥物和更多種類的細(xì)菌進(jìn)一步驗(yàn)證。

4.2 SERS-AST 法 該技術(shù)監(jiān)測細(xì)菌的活性，賦予其光譜特異性。當(dāng)細(xì)菌與不同濃度藥物混合后，由細(xì)菌表面特異性標(biāo)志物減少引起的拉曼散射(surface-enhanced Raman spectroscopic，SERS)光譜強(qiáng)度2 h內(nèi)下降，依據(jù)下降的比例反映細(xì)菌的AST結(jié)果。

研究者分別在細(xì)菌與藥物混合后培養(yǎng)的0、1、2、4、6 h進(jìn)行檢測，并監(jiān)測細(xì)菌的生長，取2 h作為檢測MIC值的最佳檢測時(shí)間，革蘭陽性菌：r730 < 0.5；革蘭陰性菌：r654<0.5 或 r724<0.5(r730/r654/r724為分別在730/cm、654/cm、724/cm處拉曼散射峰的信號率)，作為判斷抗菌藥物發(fā)揮活性的標(biāo)準(zhǔn)。MIC值檢測時(shí)間點(diǎn)定為混合培養(yǎng)后2 h，這是綜合藥物治療效果之后的經(jīng)驗(yàn)性選擇。藥物濃度設(shè)置為包含標(biāo)準(zhǔn)濃度在內(nèi)的由低至高的4個(gè)濃度，并探索性的設(shè)置最初檢測細(xì)菌濃度為1×106、1×107、1×108CFU/mL三個(gè)等次，最終選擇與微量肉湯稀釋法藥敏結(jié)果最接近的1×106CFU/mL作為檢測細(xì)菌的最初濃度[29]。

SERS-AST 法所得AST檢測結(jié)果與微量肉湯稀釋法結(jié)果基本一致，傳統(tǒng)方法需過夜培養(yǎng)，而該方法只需菌液與藥物共同培養(yǎng)2 h。研究者經(jīng)驗(yàn)性的選擇革蘭陽性菌r730 < 0.5，革蘭陰性菌r654 < 0.5 或者 r724 < 0.5作為有抗菌活性的評判標(biāo)準(zhǔn)，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證；值得一提的是該儀器的最低檢測限度為1×105CFU/mL，在一定程度上限制了MIC值的檢測；SERS-AST 法檢測成本亦不容忽視；另外，其只檢測了細(xì)菌對苯唑西林與亞胺培南的藥敏，對于抑菌劑等其他種類的藥物需要更多驗(yàn)證。

5 總結(jié)

多種檢測技術(shù)的興起為臨床提供快速的AST檢測結(jié)果，qPCR法3 h即可獲得結(jié)果[17]，敏感度高，污染低，操作容易且結(jié)果準(zhǔn)確[34]，其他方法檢測時(shí)間更短[26,29,33]，能夠獲得傳統(tǒng)藥敏檢測方法難以得到的藥敏值，特別適用于傳統(tǒng)培養(yǎng)皿中不能生長或生長緩慢的病原微生物[16]，為治療效果提供重要信息[8]，使患者從昂貴的廣譜抗菌藥物轉(zhuǎn)向更精準(zhǔn)實(shí)惠的藥物治療，有利于減少耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生。

mRNA 水平的基因表達(dá)分析結(jié)果僅能提示蛋白水平或功能學(xué)的改變，而非確證[35]。目前，僅有限的證據(jù)說明突變類型和抗菌藥物耐藥性水平有關(guān)，但不可能十分準(zhǔn)確地從分子水平預(yù)測其耐藥水平[36]。而SERS-AST 法通過監(jiān)測細(xì)菌表面特異性標(biāo)志物的光譜強(qiáng)度在不同藥物濃度中下降的比例，反映細(xì)菌的AST結(jié)果；微流控pH感應(yīng)器檢測法通過監(jiān)測細(xì)菌在不同濃度藥物中代謝產(chǎn)物引起培養(yǎng)基pH值的變化，獲得AST結(jié)果；微流控平臺檢測法利用耐藥或者敏感細(xì)菌能否在藥物干擾下修復(fù)生物膜系統(tǒng)，反映細(xì)菌的耐藥與否。

依據(jù)細(xì)菌譜進(jìn)行傳統(tǒng)法培養(yǎng)對監(jiān)測細(xì)菌生長意義重大，研究者在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)根據(jù)自己的研究目的選擇最適宜的檢測方法[7]。Lehours等[37]建議,實(shí)驗(yàn)者在標(biāo)準(zhǔn)微生物培養(yǎng)失敗后，方考慮分子生物學(xué)方法。

慶大霉素處于高濃度方有抑菌作用[38]，藥物處理至少32 h后才有對抗胞內(nèi)生長菌作用[17]，處理5 d 后才完全發(fā)揮作用[39]。由此看來，檢測慢性細(xì)胞膜滲透藥物對微生物的藥敏時(shí)，分子生物學(xué)檢測技術(shù)尚待考慮。

上述研究均有不足，大多強(qiáng)調(diào)需要更大樣本量的驗(yàn)證，并未提及檢測成本[29, 40-41]。AST檢測新技術(shù)仍在發(fā)展中，并未取代傳統(tǒng)方法[29]，檢測成本是qPCR檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床細(xì)菌AST檢測的主要障礙[16]。

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