HPLC法測定凍干粉針中AOH的含量

劉婷 楊建云 肖炳坤 楊懷霞 黃榮清

1.河南中醫(yī)藥大學藥學院，鄭州 450046；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850

AOH是一種雄甾酮衍生物，具有抗糖皮質激素活性的作用[1]。AOH能夠刺激機體細胞因子的分泌，促進輻射誘導造血損傷恢復，可以明顯提高全身輻射小鼠和獼猴的存活率，增強機體輻射后抗感染能力，有很好的抗輻射效果[2-7]。此外，組織病理學檢查和臨床試驗結果表明AOH的毒性較低[8]。AOH具有較強的抗輻射作用和較低的毒性，使其成為一個引人關注的候選抗輻射藥物，對其進行含量測定可以為藥物的有效性提供質量控制辦法。AOH不溶于水而溶于有機溶劑，將AOH做成凍干粉針注射劑，可降低給藥劑量，提高生物利用度[9]。AOH凍干粉針劑是一種注射給藥新劑型，本文建立了一種簡便、準確、可行、高效 的HPLC 分析方法，用于測定凍干粉針中AOH含量，為其質量控制奠定基礎。

1 儀器與試藥

儀器 ：Waters 2795 高效液相色譜儀（美國Waters 公司） ；2996 二極管陣列檢測器 ；Empower 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) ；BP211D型十萬分之一天平（德國塞多利斯集團） ；KQ3200 型超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），UV-2501PC 紫外分光光度儀（日本島津公司）。色譜柱 Dikma, Diamonsil C18柱 (250mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇和乙腈均為色譜純，甘露醇、吐溫80、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉均為分析純（AR），PH6.0 PBS緩沖液為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的混合液，氫氧化鈉（純度≥96%)，鹽酸（純度為36%～38%），30%過氧化氫。AOH 對照品（含量：100.02%，軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所自制）；AOH凍干粉針（含主藥100 mg/瓶）及空白輔料（軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所自制 )。

2 凍干粉針制備

稱取AOH對照品13.0g，1.5g吐溫80，3.0g甘露醇。將吐溫80加入研缽，倒入甘露醇，研勻后采用少量遞加法加入已研細 AOH 粉末，研磨均勻，加入 PBS 緩沖液，少量多次將上述藥物輔料混合物從研缽轉移至燒杯中，加入剩余PBS溶液，簡單攪拌后，水浴超聲處理15min，轉入膠體磨研磨40min，中間停機10min散熱，之后由膠體磨倒出，超聲處理15 min后，用注射器吸取1.8mL混懸液置安瓿管內，凍干得疏松狀固體后，封口即可。

3 溶液的制備

3.1 對照品溶液制備

取 AOH對照品約 25 mg，精密稱定，置 50 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

3.2 供試品溶液制備

稱取供試品約 25mg，精密稱定，置 50 mL 量瓶中，加適量甲醇超聲 15 min，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

3.3 空白溶液制備

稱取處方量的空白輔料適量，置100mL量瓶中，用甲醇適量，超聲處理15min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液。

4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

采用 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱 ；流動相 ： 乙腈 - 水（45：55）；檢測波長 206nm ；流速 1.0 mL·min-1；進樣量20 μL ；柱溫：室溫。理論塔板數(shù)以 AOH計算不低于 5000。

按上述色譜條件，將對照品溶液、供試品溶液及空白輔料溶液分別進樣，AOH 凍干粉針保留時間為 13.389 min，空白輔料在此處無色譜峰出現(xiàn)，說明輔料對 AOH檢測無影響。色譜圖見圖 1。

圖1 空白輔料

5 方法學驗證[10]

5.1 檢測限、定量限

取AOH約10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用乙腈逐級稀釋成一系列濃度，精密量取20μL，10μL，5μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在信噪比（S/N）為3：1時測得的檢測限為50ng，在信噪比（S/N）為10：1時測得的定量限為200ng。

5.2 線性關系考察

取對照品約50mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。分別量取2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL溶液于10mL量瓶中，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，取20ul進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積 A 對濃度 C(mg·mL-1)進行線性回歸，得回歸方程是A=1E+07C-60480(n=7)（r=0.9994）。結果表明,AOH凍干粉針在0.2～0.8mg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

5.3 儀器精密度試驗

取濃度約為0.5mg/mL的標準品溶液，連續(xù)進樣6次，每次20μL，以峰面積計算所得RSD為0.93%，表明儀器有良好的精密度。

5.4 穩(wěn)定性試驗

取一系列濃度為0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的供試品溶液，分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h各取20μL進樣，照“4”項下色譜條件測定峰面積。結果 24h 內 3 種濃度峰面積 RSD 分別為 0.63%、0.38%、0.68%，72h 內3 種濃度峰面積 RSD 分別為 1.47%、0.95%、1.47%，表明樣品溶液在3天內比較穩(wěn)定。

5.5 重復性試驗

分別精密稱取樣品9份，配制成濃度為0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的供試品溶液，每個濃度制備3份，照“4”項下色譜條件測定峰面積，按外標法以峰面積計算得平均標示量為0.67mg/mg。RSD為1.57%，表明方法有良好的重復性。

5.6 加樣回收測定

取AOH凍干粉5瓶，將傾出內容物混勻后，精密稱取供試品適量，9 份分別精密加入對照品適量，配制成低、中、高3種濃度，搖勻，過濾后進樣 20 μL，測定回收率，結果（見表 1）AOH 凍干粉針平均回收率為 101.72%，RSD=1.21%。說明用本法測定 AOH 凍干粉針含量準確度良好。

表 1 AOH凍干粉針加樣回收（n=9) 測定結果

5.7 專屬性考察

為進一步考察色譜系統(tǒng)的分離效果，對樣品分別進行了過氧化氫氧化破壞、堿破壞、酸破壞與加熱破壞試驗。

取AOH凍干粉適量，精密稱定，置25mL量瓶中，照下述方法進行操作：酸破壞：用5mol·L-1的氫氧化鈉10mL，90℃水浴中加熱8h，再加5mol·L-1的鹽酸，調節(jié)pH至中性，過濾，濾渣晾干；②堿破壞：用5mol·L-1的氫氧化鈉10mL，90℃水浴中加熱8h，再加5mol·L-1的鹽酸，調節(jié)pH至中性，過濾，濾渣晾干；③氧化破壞：加30%過氧化氫10mL，放置3天后于90℃水浴中加熱8h，過濾，濾渣晾干；④高溫破壞：置120℃下放置10h。取上述濾渣加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，分別進樣 20μL，照“4”項下色譜條件測定。

6 樣品分析

取3批供試品，稱取供試品約 25mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加適量甲醇超聲 15 min，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，取 AOH對照品同法操作，得對照品溶液。取上述溶液 20 μL 注入液相色譜儀，按照“4”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。批號20170301、20170302、20170303含量為0.68 mg/mg、0.69 mg/mg、0.71 mg/mg。

7 討論

7.1 波長的選擇

配制一定濃度的對照品溶液，在 190～800 nm 范圍內進行全掃描（見圖 3），可以看出本品為末端吸收，與AOH結構式中只有一個雙鍵的特征相符合，選擇 206 nm 作為檢測波長，既保證主藥能有相應吸光值，有關物質也在此波長處有較強吸收；流動相在該波長處無吸收，不會干擾被測組分。

圖2 AOH凍干粉針專屬性 HPLC 分析結果

7.2 AOH凍干粉針破壞實驗

從破壞試驗中可知，本品在高溫、氧化、堿性和酸性條件下穩(wěn)定。用檢查有關物質的色譜條件，可以檢查到過氧化氫氧化破壞、堿破壞、酸破壞、加熱破壞后的降解產(chǎn)物。本品與降解產(chǎn)物能很好分離，色譜圖見圖2。說明所建立的HPLC方法專屬性好，該色譜條件可用于AOH凍干粉的含量測定和有關物質的檢查。

7.3 輔料的影響

凍干粉針中主藥 AOH 不溶于水，可溶于有機溶劑，但輔料為水溶性，采用純有機溶劑提取，這就大大減少了輔料對其干擾，由液相色譜圖也可以進一步驗證，空白輔料對測定無干擾。

8 結論

凍干粉針劑相對于水針劑質量更穩(wěn)定，也更適合于給藥劑量較小藥物。作為一種新的輻射防護藥物，AOH給藥劑量小，對輻射有較好治療作用，制成凍干粉針劑，不僅可以提高生物利用度，也可以相對降低潛在毒副作用，進一步增加了藥物給藥方式選擇途徑。本實驗通過HPLC對凍干粉中AOH定量研究，經(jīng)方法學研究結果表明，該方法簡便、準確、重現(xiàn)性好、專屬性強，可為AOH凍干粉針劑質量標準的制訂提供可靠的依據(jù)。

[1] 胡秋菊,楊代曉,楊建云,等.GC-MS衍生化法測定大鼠血漿中內源性5-雄烯二醇及藥動學研究[J].藥物分析雜志 ,2016,36(6)：961-967.

[2] WHITNALL M H, ELLIOTT T B, HARDING R A,et al.Androstenediol stimulates myelopoiesis and enhances resistance to infection in gamma-irradiated mice[J].Int J Immun opharmacol,2000,22(1)：1-14.

[3] STICKNEY DR,DOWDING C,AUTHIER S,et al.5-Androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppressio[J]. Int Immunopharmacol,2007,7(4)：500-505.

[4] WHITNALL M H, VILLA V, SEED T M, et al. Molecular Specif i city of 5-Androstenediol as a Systemic Radioprotectant in Mice[J]. Immunopharmacology Immunotoxicology, 2005,27(1)：15-32.

[5] 丁桂榮,郭國禎.抗輻射損傷藥物的研究現(xiàn)狀[J].輻射研究與輻射工藝學.2007,25(6)：321-325.

[6] WHITNALL MH,INAL CE,JACKSON WE,et al.In vivo Radioprotection by 5-androstenediol：stimulation of the innate immune system[J].Radiat Res,2001,156(3)：283.

[7] GRACE MB,SINGH VK,RHEE JG,et al.5-AED enhances survival of irradiated mice in a G-CSF-dependent manner,stimulates innate immune cell function,reduces radiation-induced DNA damage and induces genes that modulate cell cycle progression and apoptosis[J]．Radiat Res,2012,53(6)：840.

[8] 石童,王陳,蔣輝,等.抗輻射生物藥物的研究進展[J].國際藥學研究雜志 ,2014,41(6)：658-662.

[9] 陳曉靜,何杰,楊建云,等.RP-HPLC 法測定凍干粉針中DHEA 的含量[J].現(xiàn)代儀器與醫(yī)療,2015,21(6)：71-73.

[10] 國家藥典委員.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社 ,2015： 374-377.