口蹄疫病毒3ABC單抗阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法應(yīng)用

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(光明牧業(yè)有限公司 200436)

根據(jù)新型口蹄疫疫苗生產(chǎn)工藝，用滅活疫苗免疫的動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體。因此，采用口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC單抗阻斷ELISA試驗(yàn)，可以區(qū)分免疫抗體與自然感染抗體。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)抽取基地牧場(chǎng)3-4月齡經(jīng)過(guò)口蹄疫滅活三價(jià)疫苗免疫健康犢牛30-40頭。

1.1.2試驗(yàn)試劑盒 采用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫病毒3ABC單抗阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，批次：20160912129。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1試劑盒準(zhǔn)備 試劑盒放置室溫恒溫1-2 h。

1.2.2試劑準(zhǔn)備 PBST洗滌液按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制1∶25倍稀釋。

1.2.3加入血樣 在捕獲3ABC抗原酶標(biāo)板每孔中加入80 μL血清稀釋液，然后依次加入20 μL陰、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性對(duì)照血清各平行2孔、血清樣品各一孔，混勻，封上封口膜，蓋上板蓋，室溫(18-25℃)反應(yīng)20 h。

1.2.4洗板 用PBST稀釋液連續(xù)洗滌5次，在吸水紙上拍干。

1.2.5加酶標(biāo)單克隆抗體 用血清稀釋液1∶100比例稀釋酶標(biāo)單克隆抗體，每孔加入100 μL，封口膜封口，室溫(18-25℃)孵育60 min。

1.2.6洗酶標(biāo)板 用PBST稀釋液連續(xù)洗酶標(biāo)板5次，在吸水紙上甩干。

1.2.7加底物溶液 每孔加入100 μL底物溶液，封口膜封口，室溫(18-25℃)避光作用12 min，在酶標(biāo)儀上讀取OD630值，并控制在0.5-0.6之間。

1.2.8加終止液 每孔加入100 μL終止液，輕輕震蕩混勻，在酶標(biāo)儀上讀取D450 nm吸光值。

1.2.9結(jié)果計(jì)算 1)計(jì)算陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性對(duì)照血清平均OD450值。2) 計(jì)算阻斷率公式PI=(1-測(cè)試樣品OD450值/陰性對(duì)照平均OD450值)×100%。

1.2.10實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定 1)實(shí)驗(yàn)成立條件：陰性對(duì)照平均OD450值>1.0；弱陽(yáng)性對(duì)照血清阻斷率>50%，陽(yáng)性對(duì)照血清阻斷率>70%。2)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：血清樣品PI值≥50%，判為非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性；血清樣品PI值<50%，判為陰性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

口蹄疫病毒3ABC抗體檢出率見(jiàn)表1。

表1 口蹄疫病毒3ABC抗體檢出率

3 分析

本實(shí)驗(yàn)采用基于兩種單克隆抗體(Mab)的口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體阻斷ELISA方法監(jiān)測(cè)，自2016年11月起至2017年5月結(jié)束，樣品2063份，檢出率平均值為0.82%。根據(jù)免疫登記信息，3ABC陽(yáng)性抗體犢牛都已經(jīng)口蹄疫三價(jià)苗免疫，結(jié)合后期臨床診斷，陽(yáng)性犢牛無(wú)感染口蹄疫病毒癥狀產(chǎn)生，體況健康，判為假陽(yáng)性。有文獻(xiàn)資料顯示如使用了抗原純化度不高的口蹄疫三價(jià)苗，會(huì)出現(xiàn)3ABC假性抗體，建議牧場(chǎng)在疫苗使用上盡量選擇抗原純化度較高的口蹄疫疫苗，避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生。