芝麻香型丟糟酒生產(chǎn)過程中糖化酶應(yīng)用

宗緒巖,王祥余,李 麗,劉 杰,廖華橋

(1.四川理工學(xué)院,四川自貢 643000;2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川自貢 643000;3.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司,山東青島 266000;4.日出東方太陽能股份有限公司檢測(cè)中心,江蘇連云港 222005)

在我國(guó)傳統(tǒng)的固態(tài)白酒發(fā)酵過程中丟糟是一種主要的副產(chǎn)物,據(jù)統(tǒng)計(jì)其每年產(chǎn)量高達(dá)2500 萬噸,而且這些丟糟成分復(fù)雜,容易腐壞造成環(huán)境污染,處理十分困難[1-3]。在眾多香型白酒的丟糟中,芝麻香型白酒的丟糟淀粉含量整體較高(10%～12%),富含發(fā)酵過程中殘留的各種香氣物質(zhì)[4-6]。

目前針對(duì)白酒生產(chǎn)的酶制劑研究已經(jīng)有很多[7-10],本文利用已建立的芝麻香型丟糟酒實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)模型預(yù)測(cè)各種糖化酶的使用效果,同時(shí)在相應(yīng)酒廠的生產(chǎn)線上同步進(jìn)行實(shí)驗(yàn),考察不同糖化酶對(duì)芝麻香型丟糟酒生產(chǎn)的實(shí)際影響,同時(shí)考察該模型的預(yù)測(cè)效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丟糟 山東地區(qū)某著名酒廠丟糟,丟糟前期發(fā)酵工藝為傳統(tǒng)芝麻香發(fā)酵工藝,使用窖池為磚壘花洞塞泥窖;酵母菌 安琪酵母股份有限公司生產(chǎn);液體糖化酶(E1) 安琪酵母股份有限公司生產(chǎn),15萬U/g;固體糖化酶(E2) 江蘇博力生物制品有限公司,8萬U/g;液體復(fù)合糖化酶(E3) 青島根源生物集團(tuán)生產(chǎn),18萬U/g;酒石酸鉀鈉(分析純) Aladdin?;五水硫酸銅、NaOH 分析純,MERCK;葡萄糖、麥芽糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油、琥珀酸、三糖、四糖、五糖、多糖、淀粉分解糊精、雙乙酰、甲醇、乙醇、NaOH等 均為色譜純,Sigma公司。

ME3002天平、萬分之一天平 Mettler;Waters 1515高效液相色譜(配備Waters 2414 Refractive Index Detector、Waters 2707 Autosampler、Aminex? HPX-87H Column 300 mm×7.8 mm色譜柱) Bio-Rad生產(chǎn);Milli-Q純水機(jī) Merck;樣品制備儀 SPEX? Sample Prep 1600;水浴鍋 Heto;烘箱 BINDER;搖床 Innova? 44;其余玻璃器皿 德國(guó)Duran。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室丟糟酒發(fā)酵 參照文獻(xiàn)[11],稍有改進(jìn)。使用1 L發(fā)酵瓶,每個(gè)發(fā)酵瓶中加入新鮮丟糟酒醅600 g,0.12 g安琪高活性酵母(使用前用32 ℃去離子水5 mL活化15 min),酶制劑使用劑量為糖化酶酶活17 U/g丟糟酒醅,充分混勻,E1、E2和E3分別做5個(gè)平行樣;封口前用75%酒精將發(fā)酵瓶口部及酒糟沒有接觸到的發(fā)酵瓶上部消毒,用保鮮膜封口置于環(huán)境溫度為22 ℃培養(yǎng)箱中避光發(fā)酵30 d。以大生產(chǎn)入窖丟槽酒醅為對(duì)照(CK)。

1.2.2 工廠芝麻香型丟糟酒發(fā)酵 在正常生產(chǎn)芝麻香型白酒的成熟酒醅完成蒸酒后,待酒醅溫度低于35 ℃時(shí)按照糖化酶酶活17 U/g丟糟酒醅分別加入E1、E2和E3以及0.2 kg/t安琪高活性酵母(提前活化),并混勻,每種酶制劑分別做5 個(gè)窖池,入磚壘花洞塞泥窖密封發(fā)酵30 d。以大生產(chǎn)入窖丟槽酒醅為對(duì)照(CK)。

1.2.3 樣品處理 實(shí)驗(yàn)室樣品:為保證實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,在實(shí)驗(yàn)室中需將發(fā)酵瓶中的發(fā)酵物全部轉(zhuǎn)移到密封袋中,仔細(xì)混勻后方可取樣;取得的樣品主要進(jìn)行殘淀粉測(cè)定和成熟酒醅成分測(cè)定。關(guān)于實(shí)驗(yàn)室入窖酒醅的殘淀粉測(cè)定也需遵循混勻后取樣的原則。

工廠樣品:為保證工廠數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,在工廠中需對(duì)每一甑的樣品進(jìn)行取樣,取樣點(diǎn)分為中央和四周五個(gè)點(diǎn),共計(jì)每個(gè)窖池需取樣30個(gè),混勻后取1 kg作為樣品帶回實(shí)驗(yàn)室分析。將各樣品分別用10倍質(zhì)量、100倍質(zhì)量的超純水混合振蕩后離心,上清液過0.45 μm濾膜后備用。

1.2.4 殘淀粉檢測(cè) 殘淀粉的檢測(cè)方法為酶法,原理與Megazyme試劑盒一致,利用諾維信復(fù)合淀粉酶和糖化酶代替Megazyme所用酶制劑以取得更穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果。

殘淀粉含量(%)=酶解液中還原糖量/樣品量×100

1.2.5 成熟酒醅成分檢測(cè) 成熟酒醅的成分檢測(cè)使用Waters 1515高效液相色譜,柱溫為65 ℃,流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4,流速0.6 mL/min,分析時(shí)間為30 min。將標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度的單標(biāo)溶液,分別進(jìn)樣確定出峰時(shí)間和峰面積與濃度關(guān)系,然后將樣品提取液分別進(jìn)樣分析,計(jì)算出酒精、葡萄糖、乳酸、醋酸含量。

1.2.6 原酒香氣物質(zhì)檢測(cè) 使用GC-MS檢測(cè)原酒中的香氣物質(zhì),第三方機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)檢測(cè),檢測(cè)方法見參考文獻(xiàn)[12]。

1.2.7 感觀分析 參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 33404-2016《白酒感官品評(píng)導(dǎo)則》和GB/T 33405-2016《白酒感官品評(píng)術(shù)語》。實(shí)驗(yàn)采用暗酒明評(píng)方式,選擇5位省級(jí)以上專業(yè)品評(píng)員,將酒樣分為3輪隨機(jī)呈送,酒杯采用標(biāo)準(zhǔn)白酒品酒杯,每杯倒酒約20 mL,經(jīng)品評(píng)后集體討論,給出描述性語言定性評(píng)價(jià)結(jié)果。通過感官定量描述分析方法對(duì)產(chǎn)品特征進(jìn)行品評(píng),特征定性表達(dá)可參考白酒感官特征描述語庫,選擇合適詞匯描述酒樣中的感官特征,或者選擇未涉及的其他特征描述語定性。

1.2.8 酶制劑電泳檢測(cè) 固體的E2進(jìn)行酶制劑電泳檢測(cè),方法是使用pH4.6的醋酸-醋酸鈉溶液以1∶10溶解并稀釋酶制劑,在層析柜中用磁力攪拌器于4 ℃攪拌2 h,最后在4 ℃以4000 r/min離心10 min,取上清液過0.22 μm微晶纖維素膜備用;液體的E1和E3則需用pH為4.6的醋酸-醋酸鈉溶液以1∶10稀釋,按照處理E2的方法處理即可。電泳的具體方法參見文獻(xiàn)[13]。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用Excel作圖。采用SPSS V17.0軟件,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)方法采用ANOVA(方差分析)進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)組間的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵成熟酒醅殘淀粉分析

采用酶法測(cè)定實(shí)驗(yàn)室及出窖酒醅樣品中的淀粉含量,結(jié)果分析如圖1所示。

圖1 不同生產(chǎn)條件下成熟酒醅的殘淀粉含量Fig.1 Residual starch of pit-outwaste lees by different production conditions注:不同小寫拉丁字母和不同小寫希臘字母分別代表大生產(chǎn)和小試結(jié)果差異顯著(p<0.05),圖2～圖5同。

從圖1的結(jié)果可以看出,E1、E2和E3在生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室條件下出窖酒醅殘淀粉與入窖酒醅殘淀粉(CK)含量具有顯著差異(p<0.05),且大生產(chǎn)條件下和實(shí)驗(yàn)室模擬的結(jié)果是一致的,即殘淀粉最低的是E3,大生產(chǎn)時(shí)為3.26%,實(shí)驗(yàn)室條件為3.62%,其次是E1,大生產(chǎn)時(shí)為3.90%,實(shí)驗(yàn)室條件為4.24%,殘淀粉含量最高的是E2,大生產(chǎn)時(shí)為4.01%,實(shí)驗(yàn)室條件為4.28%,且殘淀粉含量均低于入窖酒醅中殘淀粉含量(CK)4.82%。上述結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)室模型能夠預(yù)測(cè)出不同酶制劑在大生產(chǎn)條件下出窖酒糟殘淀粉方面表現(xiàn)的優(yōu)劣。復(fù)合型糖化酶E3在發(fā)酵中表現(xiàn)明顯優(yōu)于普通的糖化酶。固體糖化酶在表現(xiàn)上與液體糖化酶無顯著差異。實(shí)驗(yàn)室條件下標(biāo)準(zhǔn)差比大生產(chǎn)條件低,表明實(shí)驗(yàn)室模型的穩(wěn)定性明顯高于大生產(chǎn)條件。

2.2 發(fā)酵成熟酒醅酒精含量分析

采用HPLC法測(cè)定實(shí)驗(yàn)室及大生產(chǎn)出窖后酒醅樣品中的酒精含量,結(jié)果分析如圖2所示。

圖2 不同生產(chǎn)條件下成熟酒醅的酒精含量Fig.2 Alcohol yield in pit-out waste lees by different production conditions

從圖2的結(jié)果可以看出,由于實(shí)驗(yàn)室混勻更加充分,因此成熟酒醅的酒精含量也更高,使用E1、E2和E3的小試成熟酒醅中酒精含量分別達(dá)到了2.01%、1.99%和2.45%,遠(yuǎn)高于大生產(chǎn)樣品中酒精含量0.76%、0.83%和1.04%,同文獻(xiàn)[11]結(jié)果相一致。復(fù)合糖化酶E3在成熟酒醅酒精含量方面明顯高于其他兩種糖化酶E1和E2。比較大生產(chǎn)條件與實(shí)驗(yàn)室條件下成熟酒醅酒精含量的標(biāo)準(zhǔn)差,得到的結(jié)論與殘淀粉的表現(xiàn)一致,即實(shí)驗(yàn)室模型較大生產(chǎn)具有更高的穩(wěn)定性。結(jié)合成熟酒醅殘淀粉和成熟酒醅酒精含量可知復(fù)合酶E3相對(duì)于E1和E2多分解的殘淀粉有一定數(shù)量是被微生物轉(zhuǎn)化為酒精,從而提高了成熟酒醅的酒精含量,另外不同條件和酶制劑作用下成熟酒醅的殘淀粉和酒精含量的不同也與殘淀粉分解轉(zhuǎn)化為酒精的代謝路徑相吻合[11]。

2.3 發(fā)酵成熟酒培殘?zhí)呛糠治?/h3>

采用HPLC法測(cè)定實(shí)驗(yàn)室及大生產(chǎn)出窖后酒醅樣品中的殘?zhí)呛?結(jié)果分析如圖3所示。

圖3 不同生產(chǎn)條件下成熟酒醅的殘?zhí)呛縁ig.3 Residual glucose in pit-out waste lees by different production conditions

從圖3數(shù)據(jù)可以看出,對(duì)比相同條件下不同酶制劑的結(jié)果,大生產(chǎn)條件下E3成熟酒醅殘?zhí)呛孔畹蜑?.07%,E2與E1殘?zhí)呛坎町愶@著(p<0.05),分別為2.56%和2.46%,均高于入窖時(shí)殘?zhí)呛?.28%;在實(shí)驗(yàn)室條件下情況有所區(qū)別,殘?zhí)呛糠謩e為0.25%、0.26%和0.28%,均低于入窖時(shí)殘?zhí)呛?.28%,但是三種酶制劑成熟酒醅的殘?zhí)呛恐g無顯著性差異;對(duì)比不同條件下相同酶制劑的殘?zhí)呛靠芍?大生產(chǎn)條件下的成熟酒醅殘?zhí)呛勘葘?shí)驗(yàn)室條件下均高出近10倍,大生產(chǎn)條件下殘?zhí)堑暮棵黠@偏高的現(xiàn)象表明在大生產(chǎn)條件下能夠利用和消耗葡萄糖的微生物特別是酵母菌的數(shù)量及其活性是明顯不足的,這種不足既來源于酵母的活化工藝不足,也來源于物料的混合均勻度[3]。

結(jié)合本文殘淀粉的結(jié)論可知,酶制劑的不同雖然使得成熟酒醅殘淀粉的含量有所不同,但對(duì)這些殘淀粉來說即使所有殘淀粉的最大差距(E3:3.71%-3.26%=0.45%,轉(zhuǎn)化為葡萄糖的含量應(yīng)該低于0.5%)均轉(zhuǎn)化為葡萄糖且這些葡萄糖均得以殘留到成熟酒醅中也不能造成多達(dá)2%的殘葡萄糖的差異,證明成熟酒醅中的殘葡萄糖含量不可能僅僅受到殘淀粉分解量高低的影響,更受到發(fā)酵過程中葡萄糖被微生物的分解利用的限制,同時(shí)大生產(chǎn)條件下三種酶制劑的殘葡萄糖含量均遠(yuǎn)高于成熟酒醅殘淀粉差異所能造成的殘葡萄糖含量差異,進(jìn)一步證明了這種限制在大生產(chǎn)條件下的普遍性。

結(jié)合成熟酒醅酒精含量的分析可知,如果大生產(chǎn)成熟酒醅中的殘葡萄糖含量均以最大的轉(zhuǎn)化效率(酵母厭氧呼吸條件下葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的轉(zhuǎn)化率為51.1%)轉(zhuǎn)化為酒精,則大生產(chǎn)條件下E1、E2和E3可多得的酒分別是1.31%、1.26%、1.06%,加上已經(jīng)存在的出酒率,理論最高可分別達(dá)到2.07%、2.09%、2.10%,與實(shí)驗(yàn)室條件下所得的成熟酒醅酒精含量2.04%、1.99%和2.45%較為接近。綜上所述,提高成熟酒醅酒精含量的關(guān)鍵仍是設(shè)法減少成熟酒醅中的殘?zhí)呛俊?/p>

2.4 發(fā)酵成熟酒醅乳酸含量的分析

采用HPLC法測(cè)定實(shí)驗(yàn)室和大生產(chǎn)出窖后成熟酒醅樣品中的乳酸含量,結(jié)果分析如圖4所示。

圖4 不同生產(chǎn)條件下成熟酒醅的乳酸含量Fig.4 Lactic acid in pit-out waste lees by different production conditions

從圖4結(jié)果可以看出,大生產(chǎn)條件下E1、E2和E3成熟酒醅同入窖酒醅乳酸含量存在差異,分別為4.08%、3.74%、3.63%和3.74%,而CK、E2和E3的差異不顯著(p>0.05);E1乳酸含量最高,與僅次于它的CK存在一定差異。

在實(shí)驗(yàn)室條件下E1、E2和E3成熟酒醅乳酸含量差異均不顯著(p>0.05),同入窖酒醅乳酸含量有差異,分別為3.22%、3.32%、3.19%和3.74%。比較不同條件下相同酶的乳酸積累差距,結(jié)果表明在大生產(chǎn)條件下的乳酸含量均高于實(shí)驗(yàn)室條件,證明發(fā)酵環(huán)境的乳酸菌數(shù)量對(duì)發(fā)酵成熟酒醅中的乳酸積累有著明顯的影響。這也可能是大生產(chǎn)條件下葡萄糖積累的原因之一,乳酸含量的增加抑制了部分微生物,尤其是產(chǎn)乙醇的酵母的活性,造成其發(fā)酵變?nèi)?類似的結(jié)果在文獻(xiàn)[14-15]中也有報(bào)道。

2.5 發(fā)酵成熟酒醅醋酸含量的分析

采用HPLC法測(cè)定大生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室出窖后酒醅樣品中的醋酸含量,結(jié)果分析如圖5所示。

圖5 不同生產(chǎn)條件下成熟酒醅的醋酸含量Fig.5 Acetic acid in pit-out waste lees by different production conditions

如圖5所示,大生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室條件下E1、E2和E3成熟酒醅醋酸含量及入窖酒醅醋酸含量均無顯著差異(p>0.05),大生產(chǎn)分別為0.47%、0.41%、0.41%和0.41%,小試分別為0.32%、0.38%、0.40%和0.41%。比較不同條件下相同酶制劑的成熟酒醅醋酸含量,結(jié)果顯示醋酸含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05),證明發(fā)酵環(huán)境的醋酸菌數(shù)量及發(fā)酵過程中醋酸的積累無影響,遠(yuǎn)不如乳酸菌的影響明顯,與文獻(xiàn)[16]的結(jié)論相吻合。

2.6 大生產(chǎn)發(fā)酵原酒檢測(cè)

如表1所示,根據(jù)GC-MS結(jié)果,將大生產(chǎn)條件下酯類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和酸類物質(zhì)的比例同標(biāo)準(zhǔn)的芝麻香型白酒酯類物質(zhì)(乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯的比例為1∶0.9∶0.3∶0.1)、醇類物質(zhì)(正丙醇、異戊醇、異丁醇和正丁醇的比例為1∶0.7∶0.3∶0.2)和酸類物質(zhì)(乙酸、乳酸、己酸和丁酸的比例為1∶0.4∶0.2∶0.1)合理比例[17]進(jìn)行比較可知:酯類物質(zhì)E2最接近于合理比例,其次是E3,最后是E1;醇類和酸類物質(zhì)E2與E3較好,E1較差。

表1 大生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)原酒的氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果(mg/L)Table 1 GC-MS results of original liquor of distillery experiments(mg/L)

在原酒口感上,經(jīng)過專業(yè)品酒師感官評(píng)價(jià)得出結(jié)論:E1香氣帶有淡淡的泥香,酒體清雅淡爽,后尾味短淡,風(fēng)格與芝麻香型丟糟酒相比有所改變;E2香氣帶有愉快的焦香,味醇甜爽口,后味焦味較好;E3香氣帶有愉快的焦香,味醇甜爽口,后味焦味較好,尾比E2稍淡。結(jié)合發(fā)酵成熟酒醅酒精含量分析的結(jié)論可知E3生產(chǎn)原酒比E2味道清淡的原因應(yīng)該是發(fā)酵過程中成熟酒醅中酒精含量明顯高于E2,高出約25%,稀釋了成熟酒醅中的香氣物質(zhì)所致。

2.7 酶制劑電泳檢測(cè)

如圖6所示,對(duì)E1、E2和E3進(jìn)行電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)E1條帶最為簡(jiǎn)單,E3最復(fù)雜,明顯有多出的條帶,E2則與E1類似。結(jié)合發(fā)酵的結(jié)果,可以推測(cè)E3中多出的條帶可能對(duì)丟糟中殘淀粉的高效利用有促進(jìn)作用,但需進(jìn)一步的研究。

圖6 酶制劑電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Electrophoresis result of enzyme

3 結(jié)論與討論

通過三種糖化酶(液體糖化酶E1，固體糖化酶E2，液體復(fù)合糖化酶E3)在大生產(chǎn)條件和實(shí)驗(yàn)室模型中應(yīng)用，對(duì)比了入窖酒醅同兩種條件下成熟酒醅的殘淀粉量、酒精含量、殘?zhí)呛恳约叭樗岷痛姿岬暮浚?duì)酒醅進(jìn)行了色譜分析和感官分析。E3殘淀粉含量最低；E1、E2和E3的小試成熟酒醅中酒精含量遠(yuǎn)高于大生產(chǎn)，E3在成熟酒醅酒精含量方面明顯高于其他兩種糖化酶；大生產(chǎn)條件和實(shí)驗(yàn)室模型E3成熟酒醅殘?zhí)呛孔畹停瑑?yōu)于E1同E2，均低于入窖時(shí)殘?zhí)呛浚淮笊a(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室條件下E1，E2和E3成熟酒醅乳酸含量及入窖酒醅乳酸含量差異不大(p<0.05)；大生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室條件下E1，E2和E3成熟酒醅醋酸含量及入窖酒醅醋酸含量均無顯著性差異(p<0.05)；酯類物質(zhì)含量E2最接近于合理比例，其次是E3，最后是E1；醇類和酸類物質(zhì)E2與E3較好，E1較差。對(duì)三種酶進(jìn)行電泳分析可以得出E3多出的條帶可能與E3對(duì)丟糟中殘淀粉的高效利用有關(guān)。綜合分析，液體復(fù)合糖化酶E3效果最好 ，優(yōu)于固體糖化酶E2和液體糖化酶E1。

芝麻香型丟糟酒實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)模型可以預(yù)測(cè)實(shí)際工廠生產(chǎn)過程中成熟酒醅的殘淀粉、出酒率、殘葡萄糖等關(guān)鍵指標(biāo),為篩選合適的發(fā)酵劑提供方便;在實(shí)際工廠的生產(chǎn)中物料的混勻度對(duì)成熟酒醅中出酒率、殘淀粉有著顯著影響,同時(shí)微生物的活性特別是酵母的活化效果對(duì)成熟酒醅出酒率及殘葡萄糖含量有著更顯著影響;復(fù)合酶制劑對(duì)丟糟酒出酒率和口感均存在顯著影響,確定復(fù)合酶制劑中對(duì)丟糟酒生產(chǎn)有利的酶分子對(duì)提高丟糟酒產(chǎn)量和質(zhì)量有著一定的科研和應(yīng)用價(jià)值。

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