永年縣蛋雞新城疫免疫抗體檢測與分析

邢荷巖，宋志芳，胡孟娟

（ 1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095）

雞新城疫是養(yǎng)禽業(yè)首要注意的疾病之一，引起雞和多種禽類的急性、熱性、高度接觸性傳染病，每年給我國養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前新城疫雖然在集約化養(yǎng)殖場得到了很好的控制，但是在散養(yǎng)雞中仍然是一個普遍存在的問題。非典型的雞新城疫是由1型禽副黏病毒引起的一種疫病，常見于規(guī)模化的養(yǎng)雞場，嚴(yán)重影響了雛雞的正常生長，造成產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋效率大幅下降。當(dāng)前依據(jù)非典型新城疫的臨床癥狀和病理學(xué)變化與典型新城疫進(jìn)行區(qū)別，進(jìn)行新城疫的初步診斷，然而大部分非典型新城疫的發(fā)病和死亡率比典型新城疫低，可通過疫苗免疫接種方法來降低非典型的新城疫發(fā)生的風(fēng)險[2-3]。對332次非典型的新城疫病例進(jìn)行了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，非典型新城疫的疾病發(fā)生大多在春天5月開始逐漸地上升至春季6月，而夏天則從7月開始下降至8月，然而到秋天的9月又呈現(xiàn)急劇的上升趨勢[4]。

1 材料與方法

檢測分析永年縣蛋雞新城疫的免疫抗體水平，分別對不同批次的蛋雞群隨機(jī)選取80只，通過翼靜脈采血分離血清。依據(jù)《新城疫診斷技術(shù)規(guī)范》（GB16550-2008），采用血凝抑制試驗(yàn)對血清樣品中的新城疫免疫抗體進(jìn)行檢測[5]。

1.1 材料

1.1.1 待檢雞群

永年縣某雞場蛋雞，選取7日齡、22日齡、35日齡、60日齡、120日齡的蛋雞群各10個，每個雞群隨機(jī)選取8只。

1.1.2 器材

濾紙、試管、試管架、高壓滅菌器、離心機(jī)、離心管、內(nèi)徑2 mm聚乙烯塑料管100 cm、三棱針、酒精燈、注射器（2.5 mL）、石蠟、0.025 mm微量吸液器、96孔V型微量凝集試驗(yàn)板、恒溫培養(yǎng)箱、微型振蕩器、微量移液器、脫脂棉等。

1.1.3 藥品

標(biāo)準(zhǔn)抗原（實(shí)驗(yàn)室提供）；生理鹽水（實(shí)驗(yàn)室提供）；3.8%枸櫞酸鈉（實(shí)驗(yàn)室配制）；1%的雞紅細(xì)胞懸液（實(shí)驗(yàn)室自制）；待檢血清（永年縣選取的雞群采血后制備）。

1.2 方法

1.2.1 1%紅細(xì)胞懸液的配置

在雞翅靜脈或心臟采10 mL的血液，并且將其與枸櫞酸鈉抗凝劑混勻后，取5 mL的血樣和95 mL生理鹽水一起加入2個離心管中，2 000 r·min-1離心5 min，用吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，將已經(jīng)沉淀的紅細(xì)胞中加入稀釋液（既生理鹽水）中洗滌。再2 000 r·min-1離心5 min，吸去其中的上清液再把上面的操作步驟重復(fù)3～4次。結(jié)束操作后，用微量加樣器吸5ul的紅細(xì)胞加入495 uL理鹽水中，再充分的混勻最后則制成了1%紅細(xì)胞混懸液。

1.2.2 被檢血清的制備

在永年縣隨機(jī)選取7日齡、22日齡、35日齡、60日齡、120日齡的蛋雞群各10個，每個雞群隨機(jī)選取8只蛋雞共400只蛋雞，分別編好號后再登記，然后用已經(jīng)消過毒的干燥的注射器采血，將血液注入干凈且干燥的試管內(nèi)，在室溫中靜置或離心等待血清徹底的析出后再使用[6]。注意不能同時把一個注射器用于倆個及以上的雞只。

1.2.3 雞新城疫抗體水平檢測

現(xiàn)采用微量法來進(jìn)行雞新城疫病毒的HA試驗(yàn)與HI試驗(yàn)，再用u或v形微孔塑料板來代替經(jīng)常使用的試管[7]。在其試驗(yàn)前需要首先檢查血清有無凝集特性，如果發(fā)現(xiàn)其血清有凝集特性則需用雞紅細(xì)胞對血清進(jìn)行吸附。

血液凝集（HA）試驗(yàn)具體的操作步驟：首先用移液器向每個孔加入稀釋液1滴；用微量移液器取病毒抗原0.05 mL，加入第1孔，反復(fù)抽動6次后，吸出0.05 mL加入第2孔，在第2孔反復(fù)抽動6次后，吸出0.05 mL孔，如此連續(xù)稀釋至第11孔后吸出0.05 mL棄去。第12孔不加病毒液為紅細(xì)胞空白對照；換吸頭再吸取1%雞紅細(xì)胞懸浮液依次加入到第1～12孔，每孔加入0.05 mL；放在振蕩器上震蕩1～2 min，在室溫條件下靜置（約21℃）40 min，或者恒溫培養(yǎng)箱37℃下作用5～10 min，當(dāng)對照孔的紅細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的紐扣狀時來判定[8]。

判定血凝特性：將凝集反應(yīng)板傾斜，后再觀察其中有沒有線狀流淌，完全凝集是如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動，表明紅細(xì)胞被病毒所凝集。最高稀釋倍數(shù)作為血凝效價，這表示1個血凝單位，然后再根據(jù)初始的稀釋倍數(shù)來計(jì)算血凝的效價。也就是病毒液的HA效價以出現(xiàn)了完全凝集的抗原最大稀釋度為準(zhǔn)。HI試驗(yàn)時，病毒抗原液為0.05mL內(nèi)須含4個的凝集單位，如上所說的應(yīng)該將原病毒液作成64/4=16倍的稀釋液[9]。

紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)： 因?yàn)樾鲁且叩牟《居心t細(xì)胞的作用，且能被特異性抗體所抑制，因此可用血凝抑制試驗(yàn)測定被檢雞血清中的HI抗體效價（即滴度），能用標(biāo)準(zhǔn)血清作為新分離病毒的鑒定與未知病毒的診斷測定。

具體操作如下：用移液器向每孔加0.05 mL稀釋液，11孔加0.1 mL的稀釋液；再用移液器吸取被檢血清（或高免卵黃抗體）0.05 mL注入第1孔，抽放6次后，吸出0.05 mL，注入第2孔內(nèi)，如此連續(xù)稀釋至第10孔，并從第10孔吸出0.05 mL棄去，血清稀釋倍數(shù)依次為1：2～1 024，11孔和12孔空白；每孔再加入已標(biāo)定好的四單位病毒液0.05 mL，第11孔為紅細(xì)胞對照孔，其內(nèi)不加病毒液；置于振蕩器上振蕩上1 min，放在19～21℃靜置20 min；每孔再加入0.7%紅細(xì)胞懸浮液0.05 mL，放振蕩器上振蕩1 min，置于19～21℃下，30～60 min后再判定其結(jié)果；第11孔作為紅細(xì)胞對照孔，第12孔作為抗原對照孔。

結(jié)果觀察：首先將反應(yīng)板傾斜成45℃，觀察沉于管底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流淌者為沉淀，表明紅細(xì)胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動，表明紅細(xì)胞被病毒所凝集[10]。

將4單位的病毒物質(zhì)凝集紅細(xì)胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價，以被檢動物血清的稀釋倍數(shù)或以2為底的對數(shù)來表示。第11孔僅含稀釋液和紅細(xì)胞為不凝集對照孔，第12孔含稀釋液，病毒液和紅細(xì)胞為凝集對照孔。

2 試驗(yàn)結(jié)果

分別對不同批次的蛋雞群隨機(jī)選擇，翼靜脈采血，分離血清。依據(jù)《新城疫診斷技術(shù)規(guī)范》（GB16550-2008），采用血凝抑制試驗(yàn)對血清樣品中的新城疫免疫抗體進(jìn)行檢測。

表1 永年縣7日齡蛋雞新城疫的抗體水平（Log2）

2.1 7日齡各雞群新城疫抗體效價檢測結(jié)果

永年縣7日齡蛋雞新城疫的抗體水平見表1。

由表1可知，永年縣7日齡的蛋雞抗體水平大部分都集中在1～4滴度，其平均抗體水平集中在2～3，抗體水平低需要進(jìn)行全方面合理的疫苗接種，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等方面來提高7日齡蛋雞的抗體水平。

2.2 22日齡各雞群新城疫抗體效價檢測結(jié)果

永年縣22日齡蛋雞新城疫的抗體水平見表2。

由表2可知，永年縣22日齡的蛋雞的抗體水平大部分都集中在2～7滴度，其平均抗體水平集中在3～5，抗體水平也比較低需要進(jìn)行全方面的合理的疫苗接種，并加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等方面來提高22日齡蛋雞的抗體水平。

2.3 35日齡各雞群新城疫抗體效價檢測結(jié)果

永年縣35日齡蛋雞新城疫的抗體水平見表3。

由表3可知，永年縣35日齡的蛋雞的抗體水平大部分都集中在4～9滴度，其平均抗體水平集中在6.25～8.37，35日齡的蛋雞的抗體水平很明顯比7日齡和22日齡的蛋雞有了顯著的提高，制定合理的飼養(yǎng)管理程序保持蛋雞有較高的抗體水平。

2.4 60日齡各雞群新城疫抗體效價檢測結(jié)果

永年縣60日齡蛋雞新城疫的抗體水平見表4。由表4可知，永年縣60日齡的蛋雞的抗體水平大部分都集中在7～11滴度，其平均抗體水平集中在8～10.12，60日齡的蛋雞的抗體水平很明顯比35日齡的蛋雞抗體水平有了顯著的提高，制定合理的飼養(yǎng)管理程序保持蛋雞有較高抗體水平。

表2 永年縣22日齡蛋雞新城疫的抗體水平（Log2）

表3 永年縣35日齡蛋雞新城疫的抗體水平（Log2）

表4 永年縣60日齡蛋雞新城疫的抗體水平（Log2）

2.5 120日齡各雞群新城疫抗體效價檢測結(jié)果

永年縣120日齡蛋雞新城疫的抗體水平見表5。

由表 5可知，永年縣120日齡的蛋雞的抗體水平大部分都集中在9～12滴度，其平均抗體水平集中在9.87～11.25，120日齡蛋雞的抗體水平很明顯又比60日齡的蛋雞有了顯著的提高，同時制定合理的飼養(yǎng)管理程序可以保持蛋雞有較高的抗體水平。由此根據(jù)測定的結(jié)果來調(diào)整免疫接種的時間，可看出＞60日齡的蛋雞免疫程序比較合理，保持合理的飼養(yǎng)管理方式，可全方面的預(yù)防蛋雞新城疫疾病。

表5 永年縣120日齡蛋雞新城疫的抗體水平（Log2）

3 結(jié) 論

試驗(yàn)通過對永年縣蛋雞新城疫的檢測與分析的研究對雞新城疫方面的知識有更深入的了解，雞群接種新城疫疫苗后，再測血清中的HI抗體效價，若HI抗體效價無明顯的提高，則表示其免疫失敗，因此平時也應(yīng)該多加注意疫苗的合理的使用即疫苗的免疫途徑、疫苗的免疫接種、免疫接種的時間、免疫程序、免疫劑量等因素。為更好的預(yù)防和控制蛋雞新城疫疾病的發(fā)生，除做好了解以上相關(guān)問題外還需要對蛋雞新城疫疾病的本質(zhì)有進(jìn)一步的了解，因此需不斷的研究和探討[11-12]。

本次試驗(yàn)使用血凝和血凝抑制試驗(yàn)對邯鄲市永年縣某雞場的雞新城疫抗體檢測，判斷本地區(qū)新城疫免疫保護(hù)效果 ，試驗(yàn)結(jié)果表明，永年縣7日齡和22日齡的蛋雞抗體水平較低，35日齡和60日齡蛋雞抗體水平稍微上升，抗體水平離散程度降低，120日齡抗體水平明顯增加，其離散程度也明顯降低。結(jié)果表明，現(xiàn)有的免疫程序完全可以保護(hù)雞群免受新城疫病毒的侵襲。

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