雞源性HMGB1蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，丁 鏟

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

高遷移率族蛋白HMGB1（high mobility group box 1）是一種大小約為29 kDa的非組蛋白的核蛋白，在所有真核細胞中都表達并且在進化中高度保守[1]。它的215個氨基酸殘基形成了兩個DNA結合區(qū)（A盒和B盒）以及帶負電的C末端。HMGB1蛋白在細胞核內起到重要的作用，核內的HMGB1蛋白無序列特異性的結合至DNA小溝中，引起DNA螺旋結構的彎曲。這使其與DNA和各種因子包括p53、NF-κB、同源包含蛋白、重組激活基因1/2蛋白（RAG1/2）和類固醇激素受體之間形成物理性相互作用[2]。HMGB1蛋白可以由壞死細胞或損傷的細胞被動釋放或者通過先天性免疫細胞主動分泌到細胞外[3]。目前已知HMGB1蛋白除了作為核蛋白，同樣也是損傷相關模式分子（DAMP），參與到內毒素休克、血管損傷以及全身性炎癥反應[4]。

本研究利用RT-PCR技術從CEF細胞中擴增出雞HMGB1（chicken HMGB1，chHMGB1）基因，在0.5 mmol/L IPTG誘導下表達了chHMGB1重組蛋白，并對表達出的可溶性蛋白進行純化。同時成功制備了鼠抗chHMGB1多克隆抗體。實驗表明chHMGB1重組蛋白具有良好的免疫反應特性，以此蛋白制備的多克隆抗體可以特異性檢測到禽源細胞內的HMGB1蛋白，為進一步研究chHMGB1蛋白在細胞內發(fā)揮的生物學作用提供重要物質基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒和細胞 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）購買于天根生化科技有限公司；原核表達載體pET-28a（+）和本研究所用細胞均由上海獸醫(yī)研究所禽病研究室保存。

1.2 實驗動物 SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物有限公司；SPF級BALB/c小鼠購自斯萊克實驗動物中心。

1.3 主要試劑EcoRI 和XhoI限制性內切酶、高保真酶PrimeSTAR購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司；HRP標記二抗、FITC標記二抗和封片劑購自Sigma公司；蛋白Marker購自Thermo公司；細胞核染色液購自碧云天生物技術研究所；增強型ECL發(fā)光試劑盒購自圣爾生物公司；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清FBS購自Biological Industries公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、無EDTA胰酶購自Gbico公司；0.45 μm、0.22 μm直徑濾器購自Millipore公司。其他試劑為國產分析純試劑。

1.4 方法

1.4.1 CEF細胞制備 取9～10日齡SPF雞胚無菌去除肌肉和內臟，用DMEM培養(yǎng)基清洗后剪碎，加入無EDTA的胰酶在37℃消化20～30 min。加入胎牛血清終止消化，1500×g離心15 min后棄去上清。用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基吹懸沉淀，轉移至細胞瓶內，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2 細胞總RNA提取及反轉錄 待6孔板內CEF細胞/HeLa細胞長成單層后，每孔加入1 mL Trizol吹下細胞后收集到1.5 mL EP管內，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min后，10 000×g離心10 min。離心后取上清至新的1.5 mL EP管內，加入1 μL糖原，并按照總體積1∶1加入異丙醇，混勻后-40℃放置1 h。10 000×g離心10 min后棄去上清，用70%乙醇洗滌兩次后風干，最后用20 μL DEPC水70℃溶解5 min。取2 μg RNA作為模板，以18T為引物，按照Promega公司的Reverse Transcription System方法進行，最終獲得cDNA。

1.4.3 chHMGB1基因和huHMGB1基因的擴增 根據GenBank上公布的雞HMGB1基因和人HMGB1（human HMGB1，huHMGB1）基因的CDS序列設計并合成2對引物（chHM-F/chHM-R、huHM-F/huHM-R），其序列見表1。分別以CEF細胞和HeLa細胞的cDNA為模板，采用PrimeSTAT高保真酶進行chHMGB1/huHMGB1基因的擴增。PCR擴增條件：98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)。反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按照Axygen公司膠回收試劑盒操作說明書進行膠回收純化目的條帶。將回收的目的條帶與pZeroblunt載體連接后，轉化并提取陽性質粒送生工生物工程有限公司測序。擴增引物見表1。

表1 本研究引物Table 1 Primers in this study

1.4.4 原核表達質粒構建 為構建chHMGB1的原核表達質粒、真核表達質粒和huHMGB1的真核表達質粒，分別合成3對引物（ch28a-F/ch28a-R、chFLAG-F/chFLAG-K、huFLAG-F/huFLAG-R），引物見表1。

將測序陽性的質粒進行50倍稀釋作為模板，用上述引物進行PCR擴增。PCR產物經相應酶切后，與載體pET-28a（+）和p3×FLAG-CMV-14，4℃連接過夜、轉化，并分別涂布于卡那抗性和氨芐抗性的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落進行鑒定培養(yǎng)，菌液PCR初步鑒定正確的質粒送測序。將測序鑒定正確的重組質粒分別命名為pET-28achHMGB1、FLAG-chHMGB1和FLAG-huHMGB1。1.4.5 重組雞HMGB1融合蛋白的誘導表達 將pET-28a-chHMGB1重組質粒和pET-28a空載體分別轉化感受態(tài)BL21（DE3），挑取單菌落接種到5 mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例接種于含有卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 h時，加入0.5 mmol/L IPTG，37℃誘導表達6 h。10 800×g離心30 s收集上述大腸桿菌菌液，用PBS 緩沖液重懸菌液后超聲裂解，10 000×g離心10 min 分離上清和沉淀。以未加IPTG 誘導的pET-28a-chHMGB1和pET-28a作為對照，進行 SDS-PAGE，分析蛋白在上清和沉淀中的表達情況。

1.4.6 重組雞HMGB1融合蛋白的純化 通過實驗證明chHMGB1原核表達的融合蛋白28a-chHMGB1以可溶形式存在，離心收集菌液，與1×Ni-NAT Bind Buffer（300 mmol/L NaCl、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、10 mmol/L咪唑、1 mmol/L PMSF，pH=8.0）充分混勻后，冰水浴超聲裂解至菌液清亮，離心收集上清，在上清中加入Ni-NAT His·Bind Resin，4℃搖晃4 h后，將混合液裝入純化柱，用1×Ni-NAT Wash Buffer（300 mmol/L NaCl、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、20 mmol/L咪唑）洗滌，用1×Ni-NAT Elute Buffer（300 mmol/L NaCl、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、250 mmol/L咪唑）洗脫，采用SDS-PAGE分析蛋白洗脫情況。

1.4.7 多抗血清的制備 取純化的chHMGB1蛋白50 μg與相同體積弗式完全佐劑乳化后，腹部皮下多點注射Balb/c小鼠。首免后第14 d、28 d、42 d分別取50 μg chHMGB1蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化后，對小鼠進行3次加強免疫，最后1次免疫后第14 d小鼠眼球采血，血樣37℃放置1 h，4℃放置2 h后，4℃、2000×g離心10 min所得上清即為多克隆抗體。

1.4.8 多克隆抗體鑒定

1.4.8.1 chHMGB1多克隆抗體ELISA效價檢測 采用間接ELISA法檢測多克隆抗體效價，將純化的融合蛋白chHMGB1用CBS稀釋至5 μg/mL，每孔加入100 μL，4℃包被過夜。PBST洗滌3次后用含5%脫脂乳的PBST，4℃封閉過夜。PBST洗滌3次后，加入用PBST連續(xù)倍比稀釋的多克隆抗體血清和陰性血清，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次后每孔加入100 μL HRP標記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，洗滌后每孔加入100 μL四甲基聯苯胺（TMB）顯色液，37℃顯色10 min，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應。通過酶標儀檢測OD450值。若陽性與陰性的比值大于2.0，則視為陽性，否則為陰性。

1.4.8.2 chHMGB1多克隆抗體Western blot效價檢測 在6孔板中分別接種DF1細胞和HeLa細胞，待其長至70%時轉染FLAG-14、FLAG-chHMGB1和FLAG-huHMGB1質粒，待轉染48 h后用IP細胞裂解液裂解細胞，將已充分裂解的細胞樣品經10 000×g離心10 min后，取上清加入5×蛋白上樣緩沖液并煮沸10 min，以制備Western blot實驗所需樣品。將chHMGB1多克隆抗體和FLAG抗體（陽性對照）以適當比例稀釋后作為一抗，進行Western blot實驗。

1.4.8.3 chHMGB1多克隆抗體熒光效價檢測 將DF1細胞接種于孔底置有蓋玻片的6孔細胞板內培養(yǎng)，將細胞生長至單層后棄去培養(yǎng)基，以4%的多聚甲醛室溫固定20～30 min。PBS洗3次，加入0.5%TritonX-100室溫透化10 min。PBS洗3次，使用3%BSA 37℃封閉30 min。以500倍稀釋的chHMGB1多克隆抗體作為一抗，以免疫前陰性血清作為陰性對照，37℃孵育1 h，PBS洗3次；以1∶500倍稀釋FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，37℃避光孵育30 min，PBS洗3次；最后以1∶500稀釋DAPI染核，37℃孵育5 min，PBS洗3次。將蓋玻片取出固定于載玻片上，通過熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4.8.4 chHMGB1多克隆抗體特異性分析 6孔細胞培養(yǎng)板中鋪滿-CEF細胞、-DF1細胞、-HeLa細胞、-HEK293細胞、-MARC-145細胞、-Vero細胞、-MEF細胞、-RAW246.7細胞、-PAM細胞和-PK-15細胞，待其分別長滿時棄掉上清，用預冷的PBS洗滌2次后，每孔加入100 μL IP細胞裂解液裂解細胞，將已裂解的細胞樣品經10 000×g離心10 min后，取上清加入5×蛋白上樣緩沖液并煮沸10 min，以制備Western blot實驗所需樣品。樣品經SDS-PAGE分離后轉印至PVDF膜上，以制備的chHMGB1多克隆抗體作為一抗（1∶1000稀釋），HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶8000稀釋）作為二抗進行檢測。

2 結果

2.1 chHMGB1基因擴增及原核表達載體構建 PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析與預期大小一致，約648 bp（圖1）。重組質粒pET-28a-chHMGB1雙酶切及PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，與預期的目的片段大小相符，且測序完全正確，表明pET-28a-chHMGB1重組表達質粒構建成功。

圖1 chHMGB1基因PCR擴增Fig.1 Ampli fi cation of chHMGB1 gene

2.2 重組質粒的誘導表達及可溶性分析 SDS-PAGE分析結果顯示pET-28a-chHMGB1誘導表達的融合蛋白chHMGB1，約在27 kDa處有一條特異性條帶，而空載體對照質粒表達的蛋白中沒有此條帶，且融合蛋白主要存在于上清中。該結果說明在大腸桿菌BL21（DE3）中成功誘導了pET-28a-chHMGB1蛋白的表達，并且主要以可溶性蛋白形式表達（圖2）。

圖2 pET-28a-chHMGB1重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant pET-28achHMGB1 protein

2.3 chHMGB1多克隆抗體ELISA效價檢測結果 以純化的融合蛋白chHMGB1為包被抗原，以未免疫小鼠血清作為陰性對照，測定雞HMGB1多克隆抗體效價。多克隆抗體和陰性血清按照100×21～100×211（204 800）連續(xù)稀釋，結果顯示當多克隆抗體稀釋100×211倍時，OD陽性/OD陰性＞2.0，說明該多克隆抗體ELISA效價大于1∶204 800。

2.4 chHMGB1多克隆抗體Western blot效價檢測結果 以多克隆抗體作為一抗，檢測轉染FLAG-14、FLAG-chHMGB1和FLAG-huHMGB1質粒的HeLa細胞樣品，以針對FLAG標簽的抗體作為陽性對照。結果顯示，制備的多克隆抗體與雞HMGB1蛋白具有良好的反應性，并且條帶大小與陽性對照（FLAG抗體）一致（圖3），說明該多克隆抗體能夠特異性地識別雞HMGB1蛋白，且Western blot效價為1∶1000。

圖3 pET-28a-chHMGB1蛋白多克隆抗體Western blot檢測Fig.3 Western blot analysis of pET-28a-chHMGB1 PcAb

2.5 針對融合蛋白chHMGB1的多克隆抗體熒光效價檢測 以多克隆抗體作為一抗與DF1細胞進行間接免疫熒光檢測，結果顯示，多克隆抗體可以檢測到DF1細胞核內HMGB1蛋白的綠色熒光與DAPI藍色細胞核染料染色部位重合，而陰性血清對照組細胞核部位卻沒有綠色熒光（圖4），抗體IFA效價可達1∶500。

圖4 chHMGB1多克隆抗體間接免疫熒光效價檢測Fig.4 IFA of pET-28a-chHMGB1 PcAb

2.6 chHMGB1多克隆抗體特異性檢測 取雞源的CEF細胞和DF1細胞、人源的HeLa細胞和293細胞、猴源的Marc-145細胞和Vero細胞、鼠源的MEF細胞和RAW264.7細胞、豬源的PAM細胞和PK-15細胞樣品，以針對chHMGB1蛋白的多克隆抗體作為一抗，進行Western blot檢測，結果顯示，該多克隆抗體僅能檢測到禽源細胞中27 kDa大小的chHMGB1蛋白，而不與人源、猴源、鼠源以及豬源細胞中HMGB1蛋白反應，具有良好的細胞特異性（圖5）。

3 討論

圖5 chHMGB1多克隆抗體細胞特異性鑒定Fig.5 The cell speci fi ty of the chHMGB1 PcAb

抗體是一種特異性的檢測工具，已被廣泛應用于農業(yè)、醫(yī)藥以及生物學領域。HMGB1 除了可以作為一種核蛋白，也可以作為一種炎癥因子，參與調節(jié)病毒感染、損傷和炎癥等[2,5,6]。盡管有針對人或小鼠HMGB1的各種單克隆或多克隆抗體且與其他物種如猴、大鼠和狗具有交叉反應性，但沒有特異性識別雞HMGB1的抗體。在本研究中，我們將構建的pET-28a-chHMGB1原核表達載進行原核表達，并通過Ni-NTA柱純化原核表達chHMGB1蛋白。將純化后的重組chHMGB1蛋白免疫小鼠，以制備多克隆抗體。該多克隆抗體同時具有ELISA、Western blot和IFA效價。該抗體不僅可以與重組chHMGB1蛋白反應，還能檢測到細胞內源性chHMGB1蛋白。Western blot結果顯示該多克隆抗體種屬特異性強，僅與家禽細胞的HMGB1蛋白反應，而不與哺乳動物細胞中的HMGB1反應。這些實驗結果表明，所制備的針對chHMGB1蛋白的多克隆抗體可以被用于研究雞HMGB1蛋白的功能和其在細胞信號通路里所發(fā)揮的作用。

大量證據表明，HMGB1在多種病毒感染性疾病中發(fā)揮潛在的致病作用。丙型肝炎病毒HCV感染時，可以觀察到細胞核內的HMGB1蛋白轉移到細胞質區(qū)域，繼而又分泌至細胞外環(huán)境，而分泌至上清中的HMGB1蛋白又可以阻斷HCV的繼續(xù)感染[7]。HMGB1蛋白可以通過SARS病毒感染介導的細胞溶解而被動釋放。一旦被釋放，細胞外的HMGB1會刺激產生有害的肺部炎癥反應，從而導致呼吸衰竭和死亡。但是，目前對于HMGB1蛋白和禽源病毒之間的關系還未有明確的結論。多種禽源性病毒如禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）等天然宿主細胞都為禽源細胞，而本研究制備的特異性針對雞HMGB1蛋白的抗體未來可以用于研究雞HMGB1蛋白是否參與到禽源性病毒發(fā)病機制。

除了禽流感病毒、新城疫病毒外一些其他病毒也都已被證明可以誘導炎癥反應，且對全球養(yǎng)禽業(yè)構成嚴重威脅[8,9]。考慮到HMGB1蛋白與各種炎性疾病相關，并且釋放至細胞外環(huán)境中的HMGB1蛋白具有細胞因子樣功能，針對雞HMGB1的抗體可在未來用于確定HMGB1和禽源性病毒誘導的炎性反應之間的關系。禽類細胞在病毒感染后，原本位于細胞核的HMGB1遷移至胞質區(qū)域和進一步的釋放，可以通過使用特異性抗體進行Western blot和IFA實驗檢測。為探索HMGB1蛋白在禽病病毒復制和病毒感染激活NF-κB信號通路以及隨后的炎性因子表達中發(fā)揮的作用，通過采用特異性siRNA敲除內源性HMGB1蛋白或使用該抗體阻斷細胞外HMGB1蛋白進行研究。而這些實驗研究將對了解禽流感病毒、新城疫病毒或其他禽類病毒如何誘導過度的炎癥反應提供新的見解，為進一步研究雞HMGB1蛋白在禽源性病毒發(fā)病機制中的作用以及為找到新的潛在治療靶點提供重要的生物試劑。

[1] Dumitriu I E, Baruah P, Manfredi A A,et al. HMGB1：guiding immunity from within [J]. Trends Immunol, 2005,26(7)： 381-387.

[2] Andersson U, Tracey K J. HMGB1 is a therapeutic target for sterile inflammation and infection [J]. Annu Rev Immunol, 2011, 29： 139-162.

[3] Mazarati A, Maroso M, Iori V,et al. High-mobility group box-1 impairs memory in mice through both toll-like receptor 4 and Receptor for Advanced Glycation End Products[J]. Exp Neurol, 2011, 232(2)： 143-148.

[4] Lee S A, Kwak M S, Kim S,et al. The role of high mobility group box 1 in innate immunity[J]. Yonsei Med J,2014, 55(5)：1165-1176.

[5] Andersson U, Erlandsson-Harris H, Yang H,et al.HMGB1 as a DNA-binding cytokine [J]. J Leukoc Biol,2002,72(6)：1084-1091.

[6] Scaffidi P, Misteli T, Bianchi M E. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J]. Nature, 2002,418(6894)：191-195.

[7] Jung J H, Park J H, Jee M H,et al. Hepatitis C virus infection is blocked by HMGB1 released from virusinfected cells [J]. J Virol, 2011, 85(18)： 9359-9368.

[8] Hu Z, Hu J, Hu S,et al. High levels of virus replication and an intense inflammatory response contribute to the severe pathology in lymphoid tissues caused by Newcastle disease virus genotype VIId [J]. Arch Virol, 2015, 160(3)：639-648.

[9] Yu M, Zhang K, Qi W,et al. Expression pattern of NLRP3 and its related cytokines in the lung and brain of avian influenza virus H9N2 infected BALB/c mice [J].Virol J, 2014,11： 229.