基于高通量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證膽道閉鎖血清標(biāo)志物

鄭 超 董 瑞 余發(fā)星 鄭 珊

膽道閉鎖是一種以嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積、肝內(nèi)外膽管阻塞、肝臟進(jìn)行性纖維化并惡性進(jìn)展至肝硬化為特征的罕見(jiàn)的破壞性炎癥性疾病[1]，若不及時(shí)采取有效治療手段，多在2歲時(shí)因進(jìn)行性肝硬化而死亡[2]。早期篩查膽道閉鎖并盡快施行Kasai手術(shù)能夠很大程度地改善患兒的長(zhǎng)期預(yù)后[3]。隨著許多與膽道閉鎖發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的差異表達(dá)蛋白被不斷發(fā)現(xiàn)，采用分子標(biāo)志物獨(dú)立或聯(lián)合早期篩查膽道閉鎖成為可能。傳統(tǒng)的ELISA法、蛋白印跡法或免疫組織化學(xué)染色法，1次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)1種或幾種蛋白含量，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模、高通量的結(jié)果分析。抗體芯片技術(shù)具有微型化、集成化、高通量化的特點(diǎn)，在研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤標(biāo)志物和細(xì)胞周期調(diào)控等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。本研究利用抗體芯片技術(shù)檢測(cè)膽道閉鎖患兒血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平，為進(jìn)一步探索膽道閉鎖的發(fā)病機(jī)制及診斷策略奠定新的研究基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 倫理和知情同意 本研究方案經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象的父母均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn) 2017年1～5月于我院外科初診且未治療，經(jīng)我院外科術(shù)中探查、膽道造影及術(shù)后病理切片診斷為膽道閉鎖(膽道閉鎖組)或膽總管囊腫(對(duì)照組)，且均無(wú)肝外合并畸形。

1.3 血清樣本采集 采用惰性分離膠促凝采血管，在消毒無(wú)菌情況下，采集患兒入院后未輸血情況下的術(shù)前靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min后，3 000 r·min-1離心15 min，取上清分裝，置于-80 ℃保存待用。

1.4 抗體芯片檢測(cè)方法 抗體芯片購(gòu)自廣州瑞博奧生物科技有限公司 (Quantibody?Human Cytokine Antibody Array X00，catalog#：QAH-CAA-X00)。該抗體芯片可檢測(cè)血清樣本中的1 002種蛋白指標(biāo)，通過(guò)抗體芯片檢測(cè)陣列圖并釋放熒光信號(hào)，收集熒光信號(hào)數(shù)據(jù)后，經(jīng)過(guò)歸一化處理及t檢驗(yàn)分析。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 根據(jù)抗體芯片檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)復(fù)習(xí)文獻(xiàn)選取部分分子標(biāo)志物，采用ELISA(試劑盒購(gòu)自廣州瑞博奧生物科技有限公司，ELH-IL6-1，ELH-IL8-1，ELH-IL10-1)進(jìn)行擴(kuò)大樣本(2015年1月至2017年1月收集我院膽道閉鎖和膽總管囊腫患兒的血清樣本)的驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 膽道閉鎖組5例(表1，例1～5)，平均年齡(88.2±22.3) d，男4例，女1例；對(duì)照組3例(表1，例6～8)，平均年齡(104±9.5) d，男2例，女1例。兩組患兒年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.299，t=2.447)。

表1 膽道閉鎖組和對(duì)照組患兒的基本情況

注 ALT：IU·L-1；AST：IU·L-1；γ-GT：γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，IU·L-1；TBil：總膽紅素，μmol·L-1；DBil：直接膽紅素，μmol·L-1；WBC：×109·L-1

2.2 抗體芯片檢測(cè)情況 表2顯示，47/1 002個(gè)蛋白在兩組樣本中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，且兩者相差倍數(shù)均>1.2倍，在膽道閉鎖組中表達(dá)上調(diào)的蛋白34個(gè)，下調(diào)13個(gè)。圖1顯示表達(dá)差異蛋白的火山分布圖。

圖1 膽道閉鎖和對(duì)照組血清抗體芯片1 002個(gè)蛋白火山分布圖

注 綠色圓點(diǎn)代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，即-log 10Pvalue>1.30)且兩者倍數(shù)相差>1.2倍(即log 2 Foldchange的絕對(duì)值>0.263)的47個(gè)蛋白；紅色圓點(diǎn)代表差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白

2.3 抗體芯片蛋白信號(hào)通路和生物功能富集分析結(jié)果 對(duì)膽道閉鎖組和對(duì)照組血清差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析和GO生物分子功能以及生物功能分析。

圖2顯示，232個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集GO生化過(guò)程中所包含差異蛋白個(gè)數(shù)最多的前10個(gè)生化過(guò)程，即與膽道閉鎖差異表達(dá)蛋白相關(guān)程度最高的生化過(guò)程，結(jié)果提示膽道閉鎖主要與白細(xì)胞介導(dǎo)免疫、白細(xì)胞遷移和適應(yīng)性免疫應(yīng)答等生化過(guò)程高度相關(guān)。

圖3顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的5個(gè)包含差異蛋白相關(guān)的細(xì)胞組成成分，即與膽道閉鎖差異表達(dá)蛋白相關(guān)程度最高的細(xì)胞組成成分，包括受體復(fù)合物、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、胞膜受體復(fù)合物、基底膜和HEF-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物。

圖4顯示24個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集GO分子功能中所包含差異蛋白個(gè)數(shù)最多的前10個(gè)生物分子功能，結(jié)果提示膽道閉鎖主要與代謝物結(jié)合、受體信號(hào)蛋白活性和趨化因子活性等分子功能高度相關(guān)。

圖5顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的4個(gè)包含差異蛋白相關(guān)的KEGG信號(hào)通路，即與膽道閉鎖差異表達(dá)蛋白相關(guān)程度最高的信號(hào)通路，包括細(xì)胞因子-受體相互作用、流體剪應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、TNF信號(hào)通路和瘧疾。

表2 膽道閉鎖組和對(duì)照組血清中的差異表達(dá)蛋白

注 1)：膽道閉鎖組蛋白表達(dá)均值/對(duì)照組蛋白表達(dá)均值

圖2 膽道閉鎖組和對(duì)照組血清差異表達(dá)蛋白相關(guān)的生化過(guò)程(部分顯示)

注 橫坐標(biāo)表示對(duì)應(yīng)差異基因數(shù)/能夠?qū)?yīng)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中同類(lèi)型的差異基因數(shù)

圖3 膽道閉鎖組和對(duì)照組血清差異表達(dá)蛋白相關(guān)的細(xì)胞組成成分

注 橫坐標(biāo)表示對(duì)應(yīng)差異基因數(shù)/能夠?qū)?yīng)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中同類(lèi)型的差異基因數(shù)

圖4 膽道閉鎖組和對(duì)照組血清差異表達(dá)蛋白相關(guān)的生物分子功能(部分顯示)

注 橫坐標(biāo)表示對(duì)應(yīng)差異基因數(shù)/能夠?qū)?yīng)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中同類(lèi)型的差異基因數(shù)

圖5 膽道閉鎖組和對(duì)照組血清差異表達(dá)蛋白相關(guān)的信號(hào)通路

注 橫坐標(biāo)表示所包含的差異蛋白個(gè)數(shù)

2.4 擴(kuò)大樣本驗(yàn)證結(jié)果 根據(jù)抗體芯片檢測(cè)結(jié)果，本研究選取IL-6、IL-8和IL-10指標(biāo)[20～23]進(jìn)行驗(yàn)證，表3顯示，50例膽道閉鎖患兒和30例膽總管囊腫患兒血清IL-6、IL-8和IL-10濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-6、IL-8和IL-10在膽道閉鎖患兒血清中濃度均高于膽總管囊腫患兒。

膽道閉鎖(n=50)膽總管囊腫(n=30)tPIL-6387.753±215.113141.778±116.1144.916<0.000 1IL-8279.102±204.65795.963±109.7424.607<0.000 1IL-1095.416±104.81745.135±41.5572.3780.020 2

3 討論

膽道閉鎖是一種重大先天性膽道畸形疾病，其較差的預(yù)后及后期可能的肝移植所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)已成為威脅新生兒健康的重大問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)血液檢查發(fā)現(xiàn)，膽道閉鎖患兒結(jié)合膽紅素升高，堿性磷酸酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶亦可升高，但缺乏特異性，無(wú)法與其他嬰兒肝臟疾病進(jìn)行鑒別，必須進(jìn)一步行超聲檢查[4,5]和經(jīng)皮穿刺肝臟活檢[6]等。盡早診斷、行Kasai手術(shù)治療，方能較大改善膽道閉鎖患兒的長(zhǎng)期預(yù)后[3,7～9]。

膽道閉鎖的血清學(xué)檢查常作為輔助診斷手段，如ALT、AST、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、膽紅素和膽汁酸等，并不能作為確診手段[10,11]。血清中含有種類(lèi)繁多的蛋白質(zhì), 且這些蛋白質(zhì)的含量存在著巨大的差異。高通量技術(shù)的發(fā)展使得血清中差異表達(dá)蛋白的研究更全面和廣泛?？贵w芯片技術(shù)的應(yīng)用主要是發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)新的功能、了解蛋白功能的分子機(jī)制、分析特定刺激因素激發(fā)的信號(hào)通路、篩選藥物候選的效應(yīng)分子和發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標(biāo)志物等[12]。近年來(lái)，抗體芯片技術(shù)在腫瘤、免疫性疾病、神經(jīng)性疾病等罕見(jiàn)病中的應(yīng)用已有不少文獻(xiàn)報(bào)道[13,14]。本研究采用抗體芯片檢測(cè)血清指標(biāo)，結(jié)合其潛在的相關(guān)生物學(xué)功能信號(hào)通路分析，進(jìn)一步探索膽道閉鎖的發(fā)病機(jī)制以及診斷策略。

本研究通過(guò)比較兩組蛋白表達(dá)情況，篩選出47個(gè)差異表達(dá)蛋白，在膽道閉鎖患兒血清中表達(dá)上調(diào)34個(gè)，下調(diào)13個(gè)，部分結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。Kobayashi等[15]和Ghoneim等[16]均報(bào)道膽道閉鎖血清中ICAM-1含量高于對(duì)照組，與本研究檢測(cè)結(jié)果一致，表明ICAM-1對(duì)膽道閉鎖患兒具有診斷價(jià)值。而Leonhardt等[17]在膽道閉鎖RRV注射小鼠動(dòng)物模型的RNA檢測(cè)中檢出Granzyme A的基因表達(dá)在造模組小鼠肝臟中升高，本研究檢測(cè)結(jié)果可能進(jìn)一步揭示GranzymeA表達(dá)在膽道閉鎖中不僅在基因?qū)用嫔仙?，在蛋白層面上亦升高。Kobayashi等[18]還檢測(cè)到膽道閉鎖患兒血清中IP-10升高且其含量與膽道閉鎖患兒術(shù)后肝功能及門(mén)靜脈壓力密切相關(guān)，肝功能損害越嚴(yán)重患兒血清中IP-10含量越高，本研究檢測(cè)結(jié)果同樣顯示膽道閉鎖血清中IP-10含量增加，但是由于樣本數(shù)量有限，因此無(wú)法判斷其是否與膽道閉鎖患兒術(shù)后肝功能損害相關(guān)。既往文獻(xiàn)報(bào)道MMP-7[19]、IL-6[20]、IL-8[20～22]和IL-10[23]在膽道閉鎖患兒血清中升高，與本研究抗體芯片檢測(cè)結(jié)果一致。本研究通過(guò)擴(kuò)大樣本量檢測(cè)血清IL-6、IL-8和IL-10水平，結(jié)果顯示膽道閉鎖患兒血清中IL-6、IL-8和IL-10水平均升高，與抗體芯片結(jié)果一致，但考慮到實(shí)驗(yàn)方法及所選樣本數(shù)量和來(lái)源有所差別，因此其相差的倍數(shù)與抗體芯片結(jié)果有所差異。

本研究的結(jié)果初步表明，利用血清抗體芯片分析技術(shù)，不僅能夠?qū)ρ鍢颖局蟹彪s的多種蛋白進(jìn)行微型化、集成化、高通量化地檢測(cè)分析，也可能篩選出一些具有臨床診斷價(jià)值的膽道閉鎖血清標(biāo)志蛋白，為進(jìn)一步探索膽道閉鎖發(fā)病機(jī)制以及診斷策略奠定新的研究基礎(chǔ)。