多能干細胞誘導分化為腎臟類器官的分子機制及應用前景分析

張登祿 杜梟航 孔峰 趙升田2,

多能干細胞（pluripotent stem cell，PSC）主要包括胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）、誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）等。隨著人們對干細胞特性認識的提高，干細胞在再生醫(yī)學研究及應用領域發(fā)揮著越來越大的作用。在世界范圍內慢性腎病發(fā)病率高達10﹪，日益成為一個嚴重的公眾健康問題[1]。臨床中，慢性腎病診斷為腎小球腎炎、隱匿性腎炎、腎盂腎炎、過敏性紫癜腎炎、紅斑狼瘡腎炎、痛風腎、腎病綜合征、膜性腎病、腎病綜合征和糖尿病腎病等等。慢性腎病如未能及時有效救治，導致病情惡化進展，則隨病程遷延，慢性腎病患者將發(fā)展成為慢性腎功能不全、腎衰竭，最終形成尿毒癥，嚴重威脅患者生命。慢性腎病的病理過程是一個漸進的、不可逆的腎單位損失，而腎單位是維持腎臟功能的基本單位。因此，腎單位再生研究具有重要的研究意義及臨床價值。近年來，PSC體外誘導分化產生功能性的腎單位方法越來越成熟[2-4]。其中腎臟類器官的出現(xiàn)是腎臟再生領域中一個突破性的進展。2015年來自澳大利亞和美國的科研團隊分別于10月份和12月份在Nature雜志發(fā)表腎臟類器官的體外培育的方法與結果[3-4]。兩種方法培育出的腎臟類器官均具備腎單位的基本結構腎小管、腎小球、集合管，具有重要的應用和研究價值。

一、腎臟發(fā)育生物學基礎

在發(fā)育生物學上，哺乳動物腎臟來源于中間中胚層（intermediate mesoderm，IM）。細胞從原始體節(jié)中胚層（primitive streak mesoderm，PSM）分化形成IM。IM分化產生兩種關鍵的腎臟祖細胞（nephric progenitor cell，NPC）群體，即輸尿管芽（ureteric bud，UB）和后腎間質（metanephric mesenchy，MM），分別形成集合管和腎單位。像許多器官一樣，腎臟的發(fā)育涉及不同細胞之間相互誘導、自我組裝形成最終的腎臟結構。在哺乳動物腎臟發(fā)育中，三對排泄器官（前腎、中腎、后腎）由頭至尾依次排列。其中只有后腎成為出生后動物的永久性器官。后腎發(fā)育起始于MM產生膠質細胞源性神經生長因子誘導UB（腎管的分支）產生[5]。UB成長為間充質，然后通過二叉分支形成腎臟集合管。這種上皮分支的延長需要周圍間質分泌膠質細胞源性生長因子，同時間質需要來自UB的信號。與UB關系最為密切的間質是帽間質（capmesenchyme）。這一細胞群體需要來自頂端的信號進行增殖與自我更新，同時也可以分化成具有濾過功能的腎單位。經典的Wnt信號可以誘導帽間質經過間質上皮轉化產生腎單位[6-7]，而 FGF（FGF9，F(xiàn)GF20）、BMP（Bmp7 信號通過JNK）、低水平的Wnt信號及來自周圍間質的信號是帽間質維持和增殖所必需的。因此，器官的發(fā)育過程是生態(tài)空間內自我組裝過程。

二、PSC誘導分化成腎臟類器官的方法與分子機制

基于上述腎臟胚胎發(fā)育的機理，許多實驗室最近報道了體外誘導人PSC生成腎臟類器官的方法[2-4]。

（一）基本方法

腎臟類器官的形成分為3個主要階段。干細胞首先分化成PSM，進一步分化成IM，IM再分化成MM和UB。第一階段：干細胞分化成PSM。PSM是中胚層和內胚層的祖細胞群，可以由小鼠ESC經過激活素A（activin A）與BMP4誘導而成[8]，其中activin A決定了內胚層向前體節(jié)中胚層分化而中胚層向后PSM分化[9]。在小鼠和人的ESC分化過程中，經典的Wnt信號也可以作為PSM的誘導劑[10]。

第二階段：PSM分化成IM。原腸胚形成后，中胚層進一步產生IM、傍軸中胚層（paraxial mesoderm，PM）和側板中胚層（lateral plate mesoderm，LPM）。過去的研究認為轉錄因子OSR1是IM甚至MM形成的標志[11]，最近研究發(fā)現(xiàn)OSR1在軀體中胚層延伸至LPM[12]。PSM經BMP4/activin A，誘導后3 d會有OSR1的表達，而IM其他標志物，比如PAX2和LHX1并無表達[12-13]，這一結果提示第二階段分化需要新的生長因子的參與，F(xiàn)GF信號也可能參與該過程，F(xiàn)GF8從PSM至后軀干中胚層階段均有表達，而FGF9在IM和PM中有表達[14-15]。在體外MM的生存需要培養(yǎng)基中加入FGF2/BMP7或FGF9。在FGF2或FGF9因子的刺激下，OSR1、PAX2和LHX1共同表達，其中PAX2的表達率超過80﹪，這些都是IM的分化特征[16]。FGF9誘導IM產生是濃度依賴性的(最佳濃度為200 ng/ml）抑制LPM的分子標志FOXF1和OSR1的表達[16]。因此，F(xiàn)GF信號可以有效并特異性地誘導PSM分化成IM。

第三階段：IM分化成MM和UB。在哺乳動物發(fā)育過程中，IM分化成腎臟、性腺和腎上腺，腎管是首先形成的結構，沿著腎管從頭至尾依次排列著三對排泄器官（前腎、中腎、后腎），他們均發(fā)源于同一腎源性脊髓，只有后腎一直保留，并且成為動物永久性器官，后腎形成的關鍵是重要細胞組分之間相關誘導作用。MM通過表達GDNF促進UB生成，UB通過表達FGF9為MM的生存提供了必要條件，通過Wnt信號通路誘導腎單位的形成，每個腎單位延長或分段形成許多不同功能的細胞類型。研究證實維甲酸（retinoid acid，RA）具有促進UB生長的功能[17]，RA和BMP7能夠誘導小鼠ESC向腎系分化[18]，而FGF9可以維持小鼠腎單位祖細胞的狀態(tài)[19]。利用BMP4/activin A誘導人體胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESC）分化后，從第6天至第17天加入200 ng/ml FGF9、50 ng/ml BMP7和0.1 μmol/L RA。整個誘導過程利用RT-PCR檢測，結果顯示：hESC逐漸從PSM中胚層（MIXL1，LHX1）經IM（OSR1、PAX2、LHX1）分 化 成 MM（SIX2、WT1、GDNF、HOXD11）[16]。HOXD11的表達提示了后腎的出現(xiàn)，重要的是，腎管（輸尿管）上皮基因（C-RET、HOXB7）也同時被誘導表達，在誘導程序的第14天，ECAD+PAX2+上皮結構就已經出現(xiàn)，RA以濃度依賴的作用方式對這些早期上皮結構的形成起了促進作用，這些上皮結構和周圍間質被證明有增殖的作用。在腎臟發(fā)育過程中，陽性表達SIX2和WT1的初始間質區(qū)被ECAD+輸尿管上皮所包圍，WT1+細胞的百分比在輸尿管上皮出現(xiàn)后繼續(xù)增加，提示WT1在腎單位祖細胞和分化更好的腎結構中均有表達，在誘導分化的第22天，足細胞標志基因（SYNPO、NPHS1和WT1）、腎小管標志基因（AQP1和SLC3A1）和集合管標志基因（AQP2和SCNNB1）都有明顯表達[16]。

另外利用CHIR99021起始誘導程序，加入RA/FGF9可產生大量的輸尿管上皮，但其周圍的PAX2+MM細胞變得稀疏，相反，單獨延長FGF9誘導分化，同樣可以逐步誘導PSM、IM至MM/UB的分化，此方法可以更快地誘導干細胞表達腎臟標志物，MM基因比如SIX2表達持續(xù)時間更長[16]。另外一個輸尿管上皮標志分子GATA3與PAX2共表達于輸尿管上皮，更重要的是，輸尿管上皮周圍的MM更致密，更接近發(fā)育的腎臟，在這種方法中，PAX2在間質和輸尿管上皮均有表達，在WT1+和WT-的細胞中均有HOXD11蛋白分子的表達，這一結果提示MM的存在。

（二）腎臟發(fā)育中不同細胞群的自我組裝過程

在腎臟發(fā)育中形成了許多不同類型的細胞群，這些細胞群通過彼此間的信號轉導形成自我組裝的組織。Takasato等[16]利用CHIR99021-FGF9誘導程序對hESC進行了誘導培養(yǎng)，在第12 ～ 18天撤掉生長因子，到第18天伸長的ECAD+輸尿管上皮被幾簇間質（表達MM分子標志，WT1、SIX2和PAX2）所包圍，這種MM的形成看上去像腎單位（腎小囊），表達JAG1和CDH6蛋白，此外，連接輸尿管上皮與腎小囊腔體在腎單位成熟過程中出現(xiàn)。

腎單位形成是一個復雜的分段、形態(tài)改變和分化的過程。重聚實驗結果表明，小鼠胚腎分離成單細胞可以與不分化和分化12 d的hESC形成聚集，以聚集體形式培養(yǎng)4 d后，進行分割鑒定。hESC源的細胞誘導分化成腎臟發(fā)育的主要組分，包括PAX2+CALB+輸尿管上皮、CDH6+JAG1+早期腎囊、SIX2+WT1+NPC間質，而hESC源的細胞經BMP4/activin A-FGF9/BMP7/RA誘導只能分化成MM和UB[16]，這種細胞聚集在未分化的hESC細胞之間并不發(fā)生。

分離胚胎腎臟體外培養(yǎng)可以長成類器官：在周圍輸尿管上皮的刺激下分支產生輸尿管上皮并經歷腎單位的形成、形態(tài)改變和分段。hESC以單層細胞形式進行分化，可以用于研究不良環(huán)境對自我組裝和形態(tài)變化的影響，在IM形成之后，將細胞消化分散以不同的密度重新接種繼續(xù)培養(yǎng)，按CHIR99021-FGF9程序進行至第18天，以高密度接種的形成均勻的單層，而那些低密度接種產生許多小的、半球形的類器官分散于平板上。在上述兩種情況下，WT1+MM和ECAD+UB均有分布，而體積較小的半圓形克隆形成緊密組裝、更高級的結構，這一結果說明3D環(huán)境能夠增強自我組裝。

如果腎臟形態(tài)發(fā)生所需的細胞群都存在，培養(yǎng)hESC向腎臟方向誘導，應該可以形成腎臟類器官，不要其他支持細胞的參與。hESC分化培養(yǎng)至第18天后進行消化分離，離心形成細胞團塊，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，組織分析發(fā)現(xiàn)ECAD+小管存在輸尿管上皮分子標志PAX2、AQP2，或近端小管的分子標志AQP1和SLC3A19。同時發(fā)現(xiàn)，WT1+PAX2+MM存在于ECAD+輸尿管上皮周圍，這提示JAG1+ECAD+腎小囊形成，hESC通過培養(yǎng)分化形成的結構與正常小鼠胚胎腎臟通過分離、重聚形成的結構并沒有不同，通過3次獨立實驗證實83﹪（5/6）的細胞團塊具有自我組裝能力[16]。

在發(fā)育過程和損失修復過程中細胞均具有自我組裝的能力。在自我組裝過程中，不同的細胞類型彼此之間采用特定的模式形成復雜的結構，這一過程涉及特異性的細胞-細胞識別、配體-受體信號和細胞-基質相互作用。

hESC分化過程產生相互作用的NPC群，后者自我組裝形成早期腎臟，這體現(xiàn)了PSC分化產生腎組織技術上的巨大進步，然而，正常的腎臟發(fā)育涉及NPC自我更新與分化成腎單位之間的平衡。hESC誘導分化過程中形成許多腎小囊，但同時隨著時間推移NPC會顯著減少，產生祖細胞早熟的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象在Six2突變小鼠中可以見到，這一點是改進分化誘導方法需要特別關注的一點。方法改進的策略包括生長因子、細胞外基質和氧含量的改變，以便更充分的再現(xiàn)胚腎，此外，利用生物反應器為類器官的培養(yǎng)提供3D環(huán)境，可能有利于類器官的分化組裝。

（三）腎臟類器官誘導過程中主要信號通路

目前文獻報道比較成功腎臟類器官誘導的策略主要有兩種：BMP/FGF途徑（圖1a）；CHIR99021-FGF途徑（圖1b）。BMP/FGF途徑：首先PSC在BMP4/activin A的刺激下向PSM分化，然后在FGF9的刺激下分化成IM，IM在FGF9/BMP7/RA的刺激下分化成MM和UB，二者進一步分化成集合管、近端小管和足細胞在內的類器官。CHIR99021-FGF途徑：PSC在Wnt激動劑CHIR99021刺激下分化成PSM，后者在FGF9刺激下分化成IM，進而分化成MM和UB，兩者相互誘導分化成包含集合管、腎小管和腎小球的腎臟類器官。

圖1 腎臟類器官誘導過程中主要信號通路

三、PSC誘導分化為腎臟類器官的分子機制及應用前景分析

目前利用PSC誘導分化得到的類器官通常是不成熟的，類似于胎兒階段的器官，與真正的器官相比外形上小很多。在目前的培養(yǎng)體系中腎臟類器官通常長到直徑2 ～ 3 mm，沒有血管并且缺乏尿排出的途徑，因此無論從體積還是復雜程度上距離達到臨床移植的標準還很遠。然而，將腎臟類器官可應用于疾病模型的制備、藥物篩選和再生治療，其中再生治療包括生物組織工程和細胞治療。多細胞性和不同細胞群體之間的特定相互作用使這些結構信息可以反映腎毒性，體外缺乏可靠的對藥物毒性進行評估的模型，這是新藥開發(fā)中的一個重要障礙。藥物進入臨床需要腎毒性檢測，目前通常采用分離原代近曲小管上皮預測體內反應，這種方法并不太穩(wěn)定[20]。目前，研究正在嘗試利用人PSC誘導分化得到的腎近曲小管上皮進行腎臟毒性檢測[21]，利腎臟類器官檢測藥物腎毒性可以提高檢測的可靠性，因為近曲小管細胞周圍存在間質成分，比單純的近曲小管細胞更接近體內環(huán)境，利用成體胃腸道干細胞制備的胃類器官可用于幽門螺桿菌檢測已得到實驗論證[22]，利用患者來源的iPS細胞產生的類器官可用于建立疾病模型。當進行鑒定新的致病基因研究時，制備患者特異性的類器官有利于對新基因進行快速的功能鑒定，利用類器官開發(fā)高含量-低通量篩選模型進行特定治療藥物的篩選是可行的。一般情況下，干細胞產生的類器官由于缺乏血管通常大小是有限的。放大這樣的組織或類器官用于移植在生物工程學上是一大挑戰(zhàn)，特別是像腎臟這樣的大器官。三維旋轉培養(yǎng)已經用于改善腦類器官的結構，但開發(fā)能夠支撐類器官向更成熟體積更大的方向發(fā)展的器官培養(yǎng)器非常有必要。

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