丁苯酞對(duì)七氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

魯瑞濤

七氟醚是臨床麻醉中較為常用的一種吸入性全身麻醉藥物，近年來(lái)，有學(xué)者研究顯示，七氟醚吸入麻醉可能引起患者機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，尤其對(duì)于兒童而言，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)屬于發(fā)育期，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡而造成其學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能異常[1-3]。丁苯酞（BNP）是一種從芹菜籽中提取后經(jīng)人工合成的消旋體，是我國(guó)心腦血管領(lǐng)域中第一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥[4-5]。國(guó)內(nèi)外大量研究結(jié)果顯示，BNP在神經(jīng)細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)方面具有著積極的作用，能夠有效改善慢性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)[6-7]。而關(guān)于BNP對(duì)改善七氟醚麻醉后神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用，目前尚無(wú)研究報(bào)道。本研究探討分析BNP對(duì)七氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響 ，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、主要儀器及試劑

丁苯酞氯化鈉注射液（石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，H20100041）；七氟醚（中國(guó)Baxter公司，純度 ＞ 98﹪）；噻唑藍(lán) MTT（美國(guó) Sigma公司）；Annexin V-FITC試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；anti-GAPDH（美國(guó) Abcam 公司）；anti-Bcl-2（美國(guó) Abcam公司）；anti-Bax（美國(guó) Abcam公司）；anti-Caspase-3（美國(guó)Abcam公司）；免疫印跡試劑（碧云天生物技術(shù)公司）；細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)Gbico Invitrogen公司）。FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-rad公司）；電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-rad公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

二、方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

將孕18 d大鼠用乙醚麻醉后取其胎鼠，將胎鼠置于HBSS培養(yǎng)皿內(nèi)將其海馬組織取出。將取出的胎鼠海馬組織置于0.125﹪胰酶內(nèi)，并放于培養(yǎng)箱內(nèi)消化10 min。在4 ℃條件下100×g離心8 min，棄去上清液，然后加入DMEM將其緩慢搖勻，接種細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2 ～ 3 d進(jìn)行半量換液，體外培養(yǎng)至7 d進(jìn)行七氟醚分組處理。

（二）分組方法

將細(xì)胞分為5組，分別為對(duì)照組、七氟醚組、低劑量BNP組、中劑量BNP組以及高劑量BNP組。對(duì)照組為正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞；七氟醚組接入3﹪七氟醚混合氣體進(jìn)行培養(yǎng)；低劑量BNP組在培養(yǎng)基中加入濃度1 μmol/L的BNP處理6 h，再接入3﹪七氟醚混合氣體；中劑量BNP組在培養(yǎng)基中加入濃度5 μmol/L的BNP處理6 h，再接入3﹪七氟醚混合氣體；高劑量BNP組在培養(yǎng)基中加入濃度101 μmol/L的BNP處理6 h，再接入3﹪七氟醚混合氣體。

（三）MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率

分別于通氣處理0、24、48以及72 h時(shí)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，加入MTT至終濃度為1 mg/ml，置于孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄去培養(yǎng)液，加入100 μl DMSO搖勻，在450 nm下檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值，每組細(xì)胞均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

（四）流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞通氣處理48 h，使用PBS洗滌3次，每次洗滌5 min，使用不含EDTA的0.25﹪胰酶消化液將細(xì)胞輕輕吹打至懸浮狀態(tài)。然后加入100 μl緩沖液，5 μl Annexin V-FITC，5 μl碘化丙啶（PI），將其置于4 ℃環(huán)境下避光孵育15 min后，加入400 μl緩沖液，上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

（五）Western bolt檢測(cè)蛋白表達(dá)

采用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組通氣處理48 h后Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表達(dá)情況。使用SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，然后使用電轉(zhuǎn)儀法將蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，5 ﹪脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃搖床孵育一抗過(guò)夜。使用PBST洗膜后孵育二抗，在室溫下輕搖2 h。曝光后使用膠片進(jìn)行顯影分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，細(xì)胞生存率、細(xì)胞凋亡率采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上比較采用方差分析，以P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率

24，48，72 h，七氟醚同期處理各組細(xì)胞生存率較對(duì)照組明顯降低（P ＜ 0.05），而B(niǎo)NP各處理組細(xì)胞生存率高于單純七氟醚處理組（P ＜ 0.05），且隨著B(niǎo)NP 濃度的升高，細(xì)胞生存率升高（P ＜ 0.05，表1）。

表1 通氣處理后不同時(shí)間MTT法檢測(cè)丁苯酞對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生存率的影響（﹪， ±s）

表1 通氣處理后不同時(shí)間MTT法檢測(cè)丁苯酞對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生存率的影響（﹪， ±s）

注 ：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與七氟醚組比較，bP ＜ 0.05；與低劑量 BNP 組比較，cP ＜ 0.05；與中劑量 BNP 組比較，dP ＜ 0.05

二、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，采用七氟醚通氣處理的各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組 [七氟醚組（67.49±7.92）﹪，低劑量BNP組（60.72±8.33）﹪，中劑量 BNP組（44.95±7.21）﹪，高 劑 量 BNP組（31.86±6.50），對(duì)照組（19.42±4.58）﹪，P ＜ 0.05]，而采用 BNP處理的各組神經(jīng)系統(tǒng)凋亡率低于七氟醚組（P ＜0.05），且隨著 BNP劑量的增加，凋亡率降低（P ＜0.05，圖1）。

圖1 各組細(xì)胞凋亡情況分析

三、Western blot技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)

采用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，七氟醚通氣各組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)較對(duì)照組降低，而B(niǎo)NP處理各組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)較七氟醚組有所升高，且隨著B(niǎo)NP劑量增加Bcl-2表達(dá)增加；七氟醚通氣各組細(xì)胞Bax以及Caspase-3蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加，而B(niǎo)NP處理各組細(xì)胞Bax以及Caspase-3蛋白表達(dá)較七氟醚組有所降低，且隨著B(niǎo)NP濃度的升高Bax以及Caspase-3蛋白表達(dá)降低（圖2）。

圖2 Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白表達(dá)

討 論

多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，常用的臨床吸入性麻醉藥物七氟醚可引起機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及與之相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能異常，因此對(duì)于臨床麻醉藥物產(chǎn)生的神經(jīng)毒性已經(jīng)成為了臨床麻醉工作中亟待解決的難題[8-12]。BNP作為一種多功能的靶向治療藥物，多項(xiàng)研究結(jié)果均顯示，BNP具有預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[13-15]。因此筆者推測(cè)，是否能夠?qū)NP運(yùn)用于緩解七氟醚所引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

本研究探討分析BNP對(duì)七氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響，研究分離胎鼠神經(jīng)細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，采用七氟醚通氣處理神經(jīng)細(xì)胞后，神經(jīng)細(xì)胞生存率明顯降低，進(jìn)一步表明七氟醚可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。此外，采用BNP預(yù)處理的各組神經(jīng)細(xì)胞，其生存率均較未處理的七氟醚組有明顯改善，其中隨著B(niǎo)NP濃度的增加，神經(jīng)細(xì)胞生存率明顯增高，提示BNP預(yù)處理能夠?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用[16-17]。此外，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，使用七氟醚通氣處理后的各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高，而采用BNP預(yù)處理的各組細(xì)胞凋亡率較單純七氟醚組有所降低，同時(shí)隨著B(niǎo)NP劑量的升高凋亡率明顯降低。表明七氟醚可誘導(dǎo)神經(jīng)神經(jīng)損傷，主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)NP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用則體現(xiàn)為抑制七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。采用Western bolt技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，七氟醚可抑制神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，增加Bax蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)。Caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)蛋白和重要的凋亡執(zhí)行者；而B(niǎo)cl-2蛋白的過(guò)表達(dá)能夠有效抑制細(xì)胞的凋亡，Bax則通過(guò)抑制Bcl-2蛋白活性而促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[18-20]。七氟醚對(duì)神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2的抑制以及Bax、Caspase-3的促進(jìn)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。BNP處理后，與單純七氟醚組比較，可促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，而抑制Bax、Caspase-3表達(dá)，從而減少七氟醚所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，七氟醚可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，而B(niǎo)NP則可有效抑制七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有保護(hù)作用，其可能的機(jī)制與促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

1 王娟, 王李瑤, 顏貝, 等. 硒蛋白H減緩谷氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2016, 32(10):1130-1134.

2 劉嘉婧, 曹寧, 翟晶磊, 等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)岡田酸致神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)作用[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 42(5):377-382.

3 Hung HA, Sun GN, Keles S, et al. Dynamic regulation of schwann cell enhancers after peripheral nerve injury[J]. J Biol Chem, 2015,290(11):6937-6950.

4 何士科, 林莉, 蔡學(xué)禮. 單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂注射液聯(lián)合依達(dá)拉奉注射液對(duì)抗腦缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2017, 33(11):992-995.

5 Chen PW, Piao XH, Bonaldo P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury[J].Acta Neuropathol, 2015, 130(5):605-618.

6 沈蓓, 袁冬平, 伍城穎, 等. 芡實(shí)提取物對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及體外抗氧化活性研究[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2013,29(1):39-43.

7 Wang Y, Zhang P, Yin X, et al.Characteristics of peripheral nerve regeneration following a second nerve injury and repair[J]. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol, 2012, 40(4): 296-302.

8 Wang B, He L, Cu B, et al. Protection of ginsenoside Rg1 on central nerve cell damage and the influence on neuron apoptosis[J]. Pak J Pharm Sci, 2014, 27(6 Suppl):2035-2040.

9 劉展, 劉彥鋒. 白藜蘆醇對(duì)七氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響[J]. 臨床麻醉學(xué)雜志, 2016, 32(6):598-601.

10 Kobayashi M, Konishi H, Takai TA. A DAP12-Dependent signal promotes Pro-Inflammatory polarization in microglia following nerve injury and exacerbates degeneration of injured neurons[J]. Glia, 2015,63(6):1073-1082.

11 Li S, Wang X, Gu Y, et al. Let-7 microRNAs regenerate peripheral nerve regeneration by targeting nerve growth factor[J]. Mol Ther, 2015,23(3):423-433.

12 Zhang H, Zhang H, Dougherty PM. Dynamic effects of TNF-α on synaptic transmission in mice over time following sciatic nerve chronic constriction injury[J]. J Neurophysiol, 2013, 110(7): 1663-1671.

13 崔曉燕, 甄曉蘭, 劉雪莉. 黃芩苷對(duì)β-淀粉樣蛋白25-35引起新生大鼠原代海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2016, 32(21):1985-1988.

14 Miki A, Kanamori A, Nakamura M, et al. The expression of syntaphilin is down-regulated in the optic nerve after axonal injury[J]. Exp Eye Res, 2014, 129(8):38-47.

15 宋文婷, 徐立, 劉建勛. 腦缺血后谷氨酸及其受體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷及相關(guān)藥物研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2012, 28(6):747-750.

16 Murali SS, Napier IA, Mohammadi SA, et al. High-voltageactivated Calcium current subtypes in mouse DRG neurons adapt in a subpopulation-specific manner after nerve injury[J]. J Neurophysiol,2015, 113(5):1511-1519.

17 柏平, 吳修建, 閆東. 右美托咪啶與咪達(dá)唑侖對(duì)幼鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷及學(xué)習(xí)記憶功能的影響[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2013 (25):2966-2968.

18 覃威, 葉水芬, 范雯, 等. 蓯蓉精對(duì)MPP+誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷后GSK-3β表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志, 2016,23(6):415-420.

19 Wang YH, Zhang PX, Yin XF, et al. Characteristics of peripheral nerve regeneration following a second nerve injury and repair[J]. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol, 2012, 40(4):296-302.

20 Ying ZX, Misra V, Verge VM. Sensing nerve injury at the axonal ER:Activated Luman/CREB3 serves as a novel axonally synthesized retrograde regeneration signal[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014,111(45):16142-16147.