福林酚法測(cè)定閩產(chǎn)鹽膚木根莖中總酚酸的含量

葉永華 ，張 雙 ，游立群 ，江穎倩 ，許 文 ，2，葉 淼 ，2，徐 偉 ，2*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122）

鹽膚木Rhus chinensis Mill.為漆樹(shù)科鹽膚木屬落葉小喬木［1］，據(jù)《開(kāi)寶本草》記載鹽膚木根莖功能利水消腫、活血散瘀、行氣止痛［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：鹽膚木根莖具有改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)和血液流變性的作用［3］。其有效成分為酚酸、鞣質(zhì)、黃酮、三萜及這幾大類型化合物的苷類［2］，酚酸是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多元酚化合物，它是鹽膚木的主要成分，也是其主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［3］。用紫外分光光度法測(cè)定中藥中的酚酸、黃酮含量［4，5］比較常見(jiàn)，而目前未見(jiàn)鹽膚木根莖質(zhì)量評(píng)價(jià)報(bào)道，因此本研究建立鹽膚木根莖中總酚酸含量的測(cè)定方法，為鹽膚木質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-1800型可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；Sartorius CPA225D十萬(wàn)分之一天平［賽多利斯（上海）科學(xué)儀器有限公司］；IKA RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司）；SHB-III型循環(huán)水多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；LX-07A型多功能粉碎機(jī)（上海江信科技有限公司）；HH-Z型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器公司）。

1.2 試藥 鹽膚木產(chǎn)于福建，鹽膚木根莖于2015年12月20日購(gòu)自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，批號(hào)15122201，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為鹽膚木根莖Rhus chinensis Mill.，樣品均采用自然陰干的方法干燥。沒(méi)食子酸對(duì)照品（純度≥98.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-201204）；碳酸鈉、磷鉬鎢酸試劑、乙醇等試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱定沒(méi)食子酸25 mg放置于50 mL棕色量瓶中，加適量水超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻；再?gòu)闹芯芤迫? mL至25 mL量瓶并加水定容，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液制備 取切成塊的鹽膚木根莖，粉碎，過(guò)40目篩，取粉末0.5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入10倍量60%乙醇，精密稱定；水浴回流提取1.5 h，精密稱定，用60%乙醇補(bǔ)足減失重量，濾過(guò)，即得。

2.3 總酚酸含量測(cè)定

2.3.1 總酚酸顯色方法及波長(zhǎng)測(cè)定 依據(jù)參考文獻(xiàn)［6］測(cè)定總酚酸的方法，分別精密移取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液、供試品溶液1 mL，分別置25 mL棕色量瓶中，再加水至12 mL，按照下述總酚顯色方法顯色：加入磷鉬鎢酸試劑1 mL，最后用29%碳酸鈉溶液定容，搖勻后在30℃水中保溫35 min；再將供試品以及對(duì)照品顯色溶液分別以同樣處理的空白顯色體系為空白對(duì)照，在400～800 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，它們的最大吸收波長(zhǎng)都在760 nm左右，因此將760 nm作為總酚酸含量測(cè)定波長(zhǎng)。如圖1所示。

圖1 鹽膚木中總酚酸全波長(zhǎng)掃描圖

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL， 分別置 25 mL 量瓶中，加水至12 mL，即得不同濃度的對(duì)照品溶液。按“2.3.1項(xiàng)”總酚酸顯色的方法，按照相同處理的空白顯色體系為空白對(duì)照，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以吸光度A對(duì)濃度C建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：A＝89.874C＋0.0223，r＝0.999。 結(jié)果表明：沒(méi)食子酸在1.0～10.0 μg／mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3.3 總酚酸含量測(cè)定 按2.2項(xiàng)制備供試品溶液，取供試液 1 mL置 25 mL瓶中，按 2.3.1項(xiàng)的方法測(cè)其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，并按下式計(jì)算總酚酸得率：

總酚酸得率／%＝（總酚酸含量／藥材質(zhì)量）×100%。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 分別精密移取供試品溶液和對(duì)照品溶液1 mL，置于25 mL棕色量瓶中，按照“2.3.1項(xiàng)”顯色方法進(jìn)行顯色，用紫外分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果：對(duì)照品和供試品顯色吸光度RSD分別為0.11%和0.13%。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同批鹽膚木樣品0.5 g，6份，按“2.2項(xiàng)”制成供試品溶液；精密移取1 mL，按照“2.3.1項(xiàng)”顯色，測(cè)定其吸光度并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得該批次鹽膚木根莖中總酚酸平均含量為3.58%，RSD為2.29%。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密移取供試品溶液和對(duì)照品溶液1 mL，置于25 mL棕色量瓶中，按照“2.3.1 項(xiàng)”顯色，分別在 35、50、70、90、130、150 min，測(cè)定樣品吸光度。從表1中可知：隨著顯色時(shí)間變化，樣品吸光度逐漸下降，而在130 min內(nèi)樣品吸光度RSD為1.34%，表明樣品顯色后在130 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 回收率試驗(yàn) 取與重復(fù)性試驗(yàn)同批鹽膚木樣品0.5 g 6份，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，加入近似樣品總酚酸含有量的對(duì)照品量（沒(méi)食子酸17.8 mg），按照“2.2項(xiàng)”制成供試品溶液；精密移取1 mL，按照“2.3.1項(xiàng)”顯色方法顯色，測(cè)定其吸光度并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，測(cè)得平均回收率為98.93%，RSD為2.82%。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定 精密稱取與重復(fù)性試驗(yàn)同批鹽膚木樣品0.5 g，平行測(cè)定3份，按“2.2項(xiàng)”制成供試品溶液；精密移取1 mL，按“2.3.1項(xiàng)”顯色，以相應(yīng)的空白顯色體系試劑為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總酚酸含量。見(jiàn)表2。

表2 鹽膚木根莖中總酚酸含量測(cè)定（x±s）

3 討論

3.1 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，福林酚法具有所用的試劑量少、測(cè)定時(shí)間短、且在顯色過(guò)程相比于三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色法更穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)采用福林酚法測(cè)定閩產(chǎn)鹽膚木根莖中總酚酸的含量。福林酚法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，符合各項(xiàng)分析要求，且該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，可用于鹽膚木根莖中總酚酸的含量測(cè)定，為制定鹽膚木質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

3.2 本實(shí)驗(yàn)在供試品溶液進(jìn)行顯色時(shí)候，最后是用29%碳酸鈉溶液進(jìn)行定容。因?yàn)橐掖紳舛冗^(guò)高會(huì)導(dǎo)致碳酸鈉析出，故本實(shí)驗(yàn)采用少量供試品溶液進(jìn)行測(cè)定或者將乙醇提取溶液進(jìn)行濃縮，再重新用水去復(fù)溶。

3.3 采用福林酚法測(cè)定總酚酸時(shí)的顯色時(shí)間為35 min后，經(jīng)穩(wěn)定性考察，顯色后總酚酸吸光度在130 min內(nèi)樣品吸光度RSD為1.34%，表明樣品顯色后在130 min內(nèi)穩(wěn)定。因此為了更加精確測(cè)定鹽膚木根莖中總酚酸的含量，應(yīng)該在樣品顯色完之后，快速測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

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