敗醬草抑制大腸癌HCT-8／5-FU細(xì)胞耐藥的作用研究

周 莊 ，劉望予 ，婁云云 ，湯錦周 ，王建榮 ，陳錦緞

（1.福州市第二醫(yī)院，福建 福州 350007；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

大腸癌發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢，每年新增病例高達(dá)120萬，死亡病例也遠(yuǎn)超60萬人［1－2］。 化療是大腸癌晚期患者、轉(zhuǎn)移性患者等不適合手術(shù)患者的主要治療方式［3］，5-氟尿嘧啶（5-FU）是大腸癌化療的基礎(chǔ)用藥［4］，廣泛應(yīng)用于大腸癌治療。然而，耐藥的產(chǎn)生和毒副作用的存在是影響其臨床療效并最終導(dǎo)致治療失敗的主要原因［5］。因此，抑制耐藥性將有助于提高化療藥物療效和降低化療藥物使用濃度，從而降低化療導(dǎo)致的毒副作用。

大腸癌屬中醫(yī)“腸癖”“腸覃”范疇，以“濕熱蘊(yùn)毒下迫大腸、熱傷腸絡(luò)、毒邪成癰”為主要病機(jī)，“清熱解毒、消癰散結(jié)”是其治法治則之一［6－7］。 敗醬草屬敗醬科植物黃花敗醬、白花敗醬的干燥全草，具有清熱解毒、祛瘀止痛、消癰排膿的功效，符合大腸癌“清熱解毒、消癰散結(jié)”治法治則［8－9］，已有研究報(bào)道，敗醬草在臨床中廣泛應(yīng)用于大腸癌等惡性腫瘤的治療，且療效確切［10］?；A(chǔ)研究也證實(shí)了敗醬草具有顯著抑制大腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管新生以及抑制炎癥相關(guān)因子的作用［11-15］。然而，對大腸癌治療藥物5-FU耐藥的影響尚未見報(bào)道，因此，本課題探討了敗醬草對5-FU耐藥性的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞株和藥物 人源性腸癌細(xì)胞株HCT-8和耐5-FU的HCT-8／5-FU細(xì)胞株均購于江蘇南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；敗醬草全草購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂。

1.2 試劑 胎牛血清（FBS）、RPMI 1640空白培養(yǎng)基、含 EDTA（0.25%）的胰蛋白酶（美國 GBICO公司）；PBS、青霉素-鏈霉素（美國 Hyclone公司）；結(jié)晶紫、MTT（美國 Amresco公司）；5-FU粉末、阿霉素（美國Sigma公司）。

1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；全自動酶標(biāo)儀（美國Bio－Tek公司）；熒光倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國徠卡公司）。

2 方 法

2.1 藥物配制 敗醬草全草500 g溶入4 000 mL 80%乙醇中，加熱回流提取2次，每次30 min，提取液過濾，濾液減壓濃縮（50℃，0.01MPa）至相對密度1.05，噴霧干燥（進(jìn)出口溫度為 140℃／80℃）得干粉［16］；稱量適量提取物，用 50%DMSO 和 50%PBS溶解，配制成 250 mg／mL的儲存溶液，經(jīng)震蕩和超聲后，-20℃分裝保存?zhèn)溆茫皇褂们爸檬覝鼗謴?fù)，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基稀釋成所需的濃度并過濾，并用 DMSO 補(bǔ)齊［16］。

2.2 5-FU溶液配制 采用DMSO溶解適量的5-FU粉末，并配制成1M的存儲液，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)采用倍比稀釋法將5-FU儲存液用完全培養(yǎng)基配制成所需的使用濃度，用于細(xì)胞干預(yù)。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞置于25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%～90%時(shí)，用含EDTA的胰酶消化（每瓶加入0.8 mL胰酶，消化2～3 min）；待細(xì)胞消化下來后，加入2～3倍體積的新鮮完全培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基含10%FBS、100 U／mL青霉素和100 μg／mL 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液）中和，將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管中離心（1 000 轉(zhuǎn) ／min，3～5 min）；離心結(jié)束后，棄上清，并加入5 mL新鮮培養(yǎng)基，重懸、計(jì)數(shù)，用于后續(xù)的接種、傳代。HCT-8細(xì)胞用RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，HCT-8／5-FU 用含 15 μg／mL RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前改用不含5-FU的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長 HCT-8和HCT-8／5-FU 分別按 2×105／mL接種于 6孔板中（2 mL／孔），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，并給予不同濃度的5-FU 干預(yù)（0～200 μM）或敗醬草干預(yù)（0～2 mg／mL）。藥物干預(yù)24 h后通過倒置顯微鏡（×200）觀察細(xì)胞生長。

2.5 MTT法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的HCT-8／5-FU細(xì)胞及其親本細(xì)胞HCT-8，分別接種于96孔板（100 μL ／孔，0.8×105／mL）；細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，分別加入終濃度為 0、50、100和200 μM 5-FU 溶液 （HCT-8／5-FU 細(xì)胞和 HCT-8細(xì)胞）或 0、0.5、1、2 mg／mL 敗醬草溶液（HCT-8／5-FU細(xì)胞）干預(yù)24 h，每個(gè)劑量各3各復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄上清液，每孔加入 MTT 溶液（100 μL／孔，0.5 mg／mL）并在培養(yǎng)箱中避光孵育4 h；孵育結(jié)束后，棄 MTT 溶液，并加入 DMSO（100 μL／孔）溶解，采用全自動酶標(biāo)儀（波長為570 nm）測定OD值，并根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞的活力。以對照組細(xì)胞活力為100%，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力＝實(shí)驗(yàn)組OD值／對照組OD值×100%。

2.6 熒光倒置顯微鏡觀察阿霉素（ADM）蓄積情況取對數(shù)生長期HCT-8／5-FU細(xì)胞接種于6孔板（1×105／mL，2 mL／孔），細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，分別給予不同濃度的敗醬草溶液（0～2 mg／mL）干預(yù)24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄上清，PBS清洗3遍，加入適量的阿霉素染色溶液（5 μM，1 mL／孔），培養(yǎng)箱避光孵育后，用預(yù)冷的PBS清洗3遍，用熒光倒置顯微鏡觀察拍照（×200）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以（x±s）表示，2組數(shù)據(jù)和多組數(shù)據(jù)分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和多因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 HCT-8／5-FU細(xì)胞株對5-FU具有耐藥性驗(yàn)證 HCT-8和HCT-8／5-FU細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度5-FU（0、50、100、200 μmol／L）干預(yù)后，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)HCT-8細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓和漂浮等現(xiàn)象，而HCT-8／5-FU細(xì)胞未見明顯細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)量改變，可見其具有一定的耐藥性（圖1A）。這一現(xiàn)象進(jìn)一步通過MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，MTT檢測結(jié)果如圖1B所示：HCT-8細(xì)胞經(jīng)不同濃度5-FU干預(yù)后，細(xì)胞活力顯著降低；而HCT-8／5-FU細(xì)胞在不同濃度5-FU干預(yù)后，細(xì)胞活力下降不明顯；在相同濃度5-FU干預(yù)下，HCT-8的細(xì)胞活力顯著低于HCT-8／5-FU細(xì)胞。進(jìn)一步證實(shí)了HCT-8／5-FU細(xì)胞對5-FU具有一定的耐藥性。

圖1 HCT-8／5-FU細(xì)胞耐藥性驗(yàn)證圖（×200）

3.2 敗醬草對HCT-8／5-FU細(xì)胞生長的影響 倒置顯微鏡的觀察結(jié)果如圖2所示：不同濃度敗醬草（0.5～2 mg／mL）干預(yù)后，HCT-8／5-FU 細(xì)胞覆蓋率明顯降低，可見部分細(xì)胞變小、變圓，提示敗醬草對HCT-8／5-FU細(xì)胞的生長有一定的抑制作用。

3.3 敗醬草對HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響 如圖3所示：用不同濃度的敗醬草溶液干預(yù)24 h，HCT-8／5-FU細(xì)胞株細(xì)胞活力明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；且濃度越高，細(xì)胞活力越低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了敗醬草對HCT-8／5-FU細(xì)胞生長的抑制作用。

圖2 敗醬草對HCT-8／5-FU細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）

3.4 敗醬草溶液對HCT-8／5-FU細(xì)胞阿霉素蓄積的影響 阿霉素具有自帶熒光的特性，阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度可以反映其在細(xì)胞內(nèi)的濃度從而反映細(xì)胞膜的外排功能。本研究采用阿霉素染色和倒置熒光顯微鏡觀察不同濃度敗醬草干預(yù)對阿霉素蓄積的影響。如圖4所示：與對照組比較（熒光較弱），不同濃度敗醬草溶液（0.5～2 mg／mL）干預(yù)后，可顯著增加阿霉素（紅色熒光）在HCT-8／5-FU細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)的蓄積。結(jié)果提示敗醬草具有抑制HCT-8／5-FU細(xì)胞膜藥物外排的作用。

圖3 敗醬草對HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響

圖4 敗醬草對HCT-8／5-FU細(xì)胞阿霉素蓄積的影響（×200）

4 討論

5-FU是大腸癌化療基礎(chǔ)用藥，在體內(nèi)會轉(zhuǎn)化成氟尿嘧啶核苷酸，具有抑制DNA、RNA合成的作用［17］，臨床上廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)腫瘤的治療［4］。然而化療過程產(chǎn)生耐藥是影響化療療效和最終導(dǎo)致治療失敗的最主要原因。腫瘤化療導(dǎo)致的耐藥機(jī)制極其復(fù)雜，其中ABC家族蛋白高表達(dá)介導(dǎo)的細(xì)胞膜的外排功能異常增強(qiáng)和細(xì)胞凋亡增殖蛋白異常表達(dá)介導(dǎo)的凋亡抵抗是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥功能的主要機(jī)制之一［18］，因此，抑制腫瘤細(xì)胞生長和藥物外排功能是抑制耐藥的重要途徑之一。

中藥治療惡性腫瘤的歷史悠久，療效可佳，而且相對化療藥物，具有毒副作用較小和作用靶點(diǎn)多等特點(diǎn)?；A(chǔ)研究已證實(shí)敗醬草具有顯著抑制大腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制血管新生的作用［10-12］。本研究進(jìn)一步研究了敗醬草具有顯著抑制HCT-8／5-FU細(xì)胞的作用，同時(shí)也初步證實(shí)了敗醬草干預(yù)能夠抑制HCT-8／5-FU細(xì)胞的外排功能。可見，敗醬草對大腸癌耐藥具有一定的抑制作用。

大腸癌耐藥的發(fā)生發(fā)展過程極為復(fù)雜，其發(fā)生機(jī)制與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常調(diào)控密切相關(guān)，而敗醬草治療大腸癌具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。本研究僅從細(xì)胞層面觀察敗醬草對于大腸癌耐藥的影響，敗醬草對于大腸癌耐藥細(xì)胞的調(diào)控作用及復(fù)雜機(jī)制的研究仍有待進(jìn)一步深入。

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