海參硫酸軟骨素的熒光標(biāo)記方法

王 俊，吳反修，常耀光,*，陳 豐，續(xù)曉琪

海參硫酸軟骨素（sea cucumber chondroitin sulfates，CHS）是海參體壁的主要組成物質(zhì)之一，屬于類硫酸軟骨素，具有硫酸軟骨素骨架，但與其他動(dòng)物組織來源的硫酸軟骨素不同，CHS的結(jié)構(gòu)中還含有硫酸酯化的L-巖藻糖支鏈，是一種新穎的多糖結(jié)構(gòu)[1]。CHS已被證實(shí)具有多種生理調(diào)節(jié)功能，包括抗凝血[2-3]、抗血栓[4]、降血糖[5-7]、抗腫瘤[8]及抗胃潰瘍[9]等，在功能食品開發(fā)方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力[10-12]。多糖類物質(zhì)普遍缺乏特異的發(fā)光或發(fā)色基團(tuán)，這為深入研究多糖的吸收代謝、生理功能機(jī)理、生物分子間相互作用等科學(xué)問題帶來阻礙[13]。這一情況同樣存在于CHS的研究中。對多糖進(jìn)行特異性標(biāo)記是克服上述問題的有效策略，目前常用的標(biāo)記方法包括同位素標(biāo)記法、熒光標(biāo)記法等幾類。相比于同位素標(biāo)記法，熒光標(biāo)記法能夠避免放射性危害，且標(biāo)記產(chǎn)物亦具有良好的檢測靈敏度及特異性[14]。韓章潤等[15]對鯊魚頭骨來源的硫酸軟骨素進(jìn)行熒光標(biāo)記，并利用標(biāo)記產(chǎn)物成功研究了該糖與蛋白質(zhì)的相互作用。苗本春等[16]實(shí)現(xiàn)了海洋硫酸多糖911的熒光標(biāo)記，并將熒光標(biāo)記物作用于淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，以尋找海洋硫酸多糖911的抗體。胡錦珍等[17]用異硫氰酸熒光素對殼聚糖進(jìn)行標(biāo)記，通過測定熒光標(biāo)記物經(jīng)小鼠口服后在體內(nèi)各組織中的分布及排泄情況，研究了殼聚糖在動(dòng)物體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。

關(guān)于CHS的熒光衍生尚鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。多糖熒光標(biāo)記需根據(jù)多糖的結(jié)構(gòu)特征合理選擇或設(shè)計(jì)熒光染料及衍生方法。常見的多糖衍生熒光染料包括6-氨基熒光素（6-aminofluorescein，F(xiàn)A）、異硫氰酸熒光素、異硫氰酸羅丹明B等，可以用于連接熒光染料的多糖結(jié)構(gòu)基團(tuán)包括羥基、氨基、羧基、半縮醛基等，衍生方法包括溴化氰活化法[18-19]、末端還原胺化反應(yīng)[20-21]、碳酰化反應(yīng)法[22-24]、1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺偶聯(lián)法[15]、二甲基亞砜/二月桂酸二丁基錫法[25-28]等。溴化氰活化法針對羥基進(jìn)行衍生，對于多糖類化合物有較好的普適性，且具有操作過程簡單、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)；FA作為熒光素類染料中重要的熒光探針之一，具有高選擇性、高穩(wěn)定性和高靈敏性的優(yōu)點(diǎn)。

本研究擬利用溴化氰活化法對CHS的羥基進(jìn)行活化衍生，進(jìn)而嘗試以FA對CHS進(jìn)行標(biāo)記。通過薄層色譜法（thin layer chromatograph，TLC）及串聯(lián)有熒光檢測器與示差檢測器的凝膠排阻高效液相色譜（high performance size exclusion chromatograph coupled with florescence detector and refractive index detector，HPSEC-FLD-RID）對衍生標(biāo)記前后的多糖進(jìn)行分析，判斷標(biāo)記的效果；利用HPSEC-FLD-RID、離子色譜及傅里葉變換紅外光譜，分析標(biāo)記前后多糖化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)的變化；進(jìn)一步考察不同pH值及NaCl濃度環(huán)境中標(biāo)記產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度及穩(wěn)定性，以探討標(biāo)記產(chǎn)物的適用范圍，旨在實(shí)現(xiàn)CHS的熒光標(biāo)記，以期為該多糖的吸收代謝過程、功能機(jī)理、生物分子間相互作用等進(jìn)一步研究提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活仿刺參（Apostichopus japonicas）購于青島南山水產(chǎn)市場；CHS按照Xu Xiaoqi等[29]的方法進(jìn)行提取，海參體壁勻漿后以木瓜蛋白酶進(jìn)行蛋白酶解，向蛋白酶解液中加入氯化十六烷基吡啶沉淀粗多糖，粗多糖經(jīng)Express-Ion D離子交換樹脂分離后得到純化的CHS組分。

G60F254硅膠板 德國Merck有限公司；Express-Ion D離子交換樹脂 英國Whatman公司；Sephadex G25凝膠填料美國GE公司；6-氨基熒光素 上海Aladdin有限公司；Dextran系列分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（5、12、50、148、410、670、1 400 kDa） 美國Sigma公司；其他試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司；ICS-2000離子色譜儀 美國Dionex公司；1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；TSK-gel Super AWM-H色譜柱（150 mm×6.0 mm） 日本Tosoh公司；Sephadex G25色譜柱、?KTA prime plus蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司；ALPHA 1-4LD冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；F-4600熒光光譜儀 日本日立有限公司；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；GIS-2008數(shù)碼凝膠成像儀 天能科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CHS的熒光衍生

以FA為熒光染料，通過共價(jià)衍生的方式對CHS進(jìn)行熒光標(biāo)記，反應(yīng)條件及試劑比例如下：將4.0 mL CHS溶液（25 mg/mL）與875 μL溴化氰溶液（85 mg/mL）混合，以0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH值至11.0，25 ℃振蕩下活化反應(yīng)15 min，之后超聲處理5 min；利用Sephadex G25色譜柱將反應(yīng)液中的緩沖液置換為0.2 mol/L pH 8.0 Na2B4O7-H3BO3緩沖液，后續(xù)加入17.5 mg FA固體試劑，溶解后25 ℃避光反應(yīng)12 h；利用Sephadex G25色譜柱將反應(yīng)物中的緩沖液置換為水，以脫除反應(yīng)物中的游離FA及鹽，產(chǎn)物真空冷凍干燥后避光保存用于后續(xù)分析，記為CHS-FA[30]。

以TLC分析CHS及CHS-FA，從而判斷熒光標(biāo)記是否成功。TLC分析采用G60F254預(yù)制硅膠板，展開劑為正丙醇-水溶液（3∶1，V/V），展開后利用凝膠成像儀在365 nm波長紫外光源的照射下采集熒光信號。

以HPSEC-FLD-RID對比分析CHS及CHS-FA，進(jìn)一步確證熒光標(biāo)記的效果。高效液相色譜儀測定條件如下[31-32]：色譜柱為TSK-gel Super AWM-H（150 mm×6.0 mm）；流動(dòng)相為0.2 mol/L NaCl；流速為0.6 mL/min；柱溫30 ℃；熒光檢測器激發(fā)波長設(shè)為495 nm，發(fā)射波長設(shè)為520 nm。

以pH 8.0的50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（含0.1 mol/L NaCl）將FA與CHS-FA樣品分別配制成2 μmol/L和0.1 mg/mL的溶液，利用熒光分光光度計(jì)的3D掃描模式對CHS-FA及FA進(jìn)行全波長掃描，確定CHS-FA最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長，波譜掃描范圍：激發(fā)波長450～550 nm，發(fā)射波長450～600 nm。

熒光標(biāo)記物CHS-FA的標(biāo)記度定義為單位物質(zhì)量的多糖標(biāo)記物中含有的FA的物質(zhì)的量，按照下式進(jìn)行計(jì)算。

式中：CHS-FA中FA的物質(zhì)的量以CHS-FA在激發(fā)波長495 nm和發(fā)射波長520 nm處的熒光值進(jìn)行定量，物質(zhì)溶解于pH 8.0的50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（含0.1 mol/L NaCl）中，以FA為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。CHS-FA物質(zhì)的量以其還原端物質(zhì)的量表征，還原端的物質(zhì)的量測定采用3,5-二硝基水楊酸法。

1.3.2 衍生前后樣品的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)分析

依據(jù)高效凝膠排阻色譜法的原理，根據(jù)HPSEC-FLD-RID譜圖中CHS及CHS-FA的洗脫時(shí)間計(jì)算其分子質(zhì)量，利用系列分子質(zhì)量的Dextran標(biāo)準(zhǔn)品（5、12、50、148、410、670、1 400 kDa）建立分子質(zhì)量與洗脫時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以離子色譜法測定衍生前后多糖的SO42-含量[33]。取待測樣品減壓干燥1 d，稱量2～5 mg于安瓿瓶中，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸并封口，于110 ℃下水解10 h。水解完畢后80 ℃揮干三氟乙酸，以超純水定容到25 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾后準(zhǔn)備上樣。以離子色譜儀測定樣液中的SO42-含量：色譜柱為Ionpac AS11-HC（250 mm×4 mm）；保護(hù)柱為Ionpac AG11-HC（50 mm×4 mm）；柱溫為30 ℃；抑制器為ASRSULTRAⅡ陰離子抑制器（抑制電流50 mA）；檢測器為電導(dǎo)檢測器；淋洗液為20 mmol/L KOH溶液；流速1.2 mL/min。以無水NaSO為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定S24的量，樣品SO24-含量以多糖中SO24-的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表征。

利用傅里葉變換紅外光譜法對衍生前后多糖的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行對比分析，取1 mg干燥的樣品與KBr均勻混合并壓制成片，以傅里葉變換紅外光譜進(jìn)行分析，光譜儀參數(shù)如下：掃描范圍400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)64 次，分辨率4.0。

1.3.3 環(huán)境因素對CHS-FA熒光強(qiáng)度的影響

將CHA-FA分別溶解于pH 2～12的緩沖液中（pH 2～6使用50 mmol/L Na2HPO4-C6H8O7緩沖液，pH 7～8使用50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 9～10使用50 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液，pH 11～12使用50 mmol/L Na2HPO4-NaOH緩沖液），質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL。測定不同pH值條件下CHS-FA的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長495 nm、發(fā)射波長520 nm），以此考察環(huán)境pH值對標(biāo)記產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響。樣品在室溫下貯存7 d，每隔24 h進(jìn)行取樣，測定熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的情況，并利用TLC及HPSEC-FLD-RID對貯存終點(diǎn)樣品進(jìn)行分析，以考察不同pH值條件下CHS-FA熒光的穩(wěn)定性。

向CHS-FA溶液（0.01 mg/mL，溶于pH 8.0的50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液）中加入NaCl，調(diào)節(jié)溶液NaCl濃度為0～2 mol/L，測定不同條件下CHS-FA的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長495 nm、發(fā)射波長520 nm），以考察NaCl濃度對標(biāo)記產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響。樣品在室溫下貯存7 d，每隔24 h進(jìn)行取樣，測定熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的情況，并利用TLC及HPSEC-FLD-RID對貯存終點(diǎn)樣品進(jìn)行分析，進(jìn)而考察不同NaCl濃度條件下CHS-FA熒光的穩(wěn)定性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)及測試均進(jìn)行3 次或以上，結(jié)果以 ±s表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0分析軟件，顯著性差異分析采用Duncan’s ANOVA檢測，以P＜0.05作為顯著性差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CHS-FA的制備

圖1 CHS及熒光標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物CHS-FA的TLC分析Fig. 1 TLC analysis of fluorescence-labeled CHS and CHS-FA

相對于衍生前多糖CHS，衍生產(chǎn)物CHS-FA的得率為（62.3±4.9）%。TLC分析表明（圖1），未經(jīng)熒光衍生的原始CHS未表現(xiàn)出熒光，證實(shí)其本身缺乏熒光基團(tuán)；衍生產(chǎn)物CHS-FA呈現(xiàn)可見的熒光，表明經(jīng)衍生反應(yīng)后的多糖衍生產(chǎn)物帶有熒光發(fā)色物質(zhì)；同時(shí)，CHS-FA的熒光集中在TLC原點(diǎn)位置，與CHS高分子質(zhì)量多糖的分子特征相符合，并與游離FA熒光染料的遷移率有明顯差異，證明CHS-FA中的熒光物質(zhì)并非游離FA而是與CHS形成共價(jià)結(jié)合。TLC分析結(jié)果初步證明CHS熒光標(biāo)記成功。

圖2 CHS及CHS-FA的HPSEC-FLD-RID分析色譜圖Fig. 2 HPSEC-FLD-RID spectra of CHS and CHS-FA

圖3 CHS-FA和FA的3D全波長掃描圖Fig. 3 3D scanning spectra of CHS-FA and FA

如HPSEC-FLD-RID圖譜（圖2）所示，CHS未見熒光信號而標(biāo)記產(chǎn)物CHS-FA展現(xiàn)出清晰的熒光信號峰；CHS-FA熒光檢測器信號及示差檢測器信號的洗脫時(shí)間相符，表明熒光基團(tuán)與CHS發(fā)生結(jié)合。上述結(jié)果進(jìn)一步確證熒光衍生過程可賦予CHS熒光發(fā)色基團(tuán)，即成功實(shí)現(xiàn)了CHS的熒光標(biāo)記。

CHA-FA呈現(xiàn)出典型的熒光光譜特性（圖3）。CHS-FA在激發(fā)波長為495 nm、發(fā)射波長為520 nm的條件下熒光強(qiáng)度最大（圖3A），熒光染料FA的最佳激發(fā)波長為490 nm、發(fā)射波長為520 nm（圖3B），兩者熒光光譜特征相似。

標(biāo)記產(chǎn)物CHS-FA的標(biāo)記度為4.4±0.3，即經(jīng)衍生后每分子CHS約含4.4分子FA。Glabe等[30]利用FA標(biāo)記硫酸軟骨素，其標(biāo)記度為2.9；在Arnosti等[34]研究中，1分子硫酸軟骨素可被1.5分子FA所標(biāo)記。依據(jù)參考文獻(xiàn)[30,34]判斷，CHS的標(biāo)記度水平合理。標(biāo)記度過低，標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度不足，不利于后續(xù)的觀察分析。而標(biāo)記度過高，可能導(dǎo)致標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)特征發(fā)生明顯變化，從而改變原有功能，為功能機(jī)理研究、構(gòu)效關(guān)系研究等帶來干擾?；诖吮尘埃狙芯窟M(jìn)一步研究了FA衍生對CHS結(jié)構(gòu)的影響。

2.2 熒光衍生對CHS化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)的影響

如HPSEC-FLD-RID分析色譜圖（圖2B）所示，熒光標(biāo)記前后的多糖在凝膠排阻色譜柱上的洗脫時(shí)間未發(fā)生明顯變化，根據(jù)洗脫時(shí)間計(jì)算CHS及CHS-FA的分子質(zhì)量，測得CHS的分子質(zhì)量為（58.0±5.2）kDa，CHS-FA的分子質(zhì)量為（59.4±2.8）kDa，兩者間不存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果表明，衍生標(biāo)記前后CHS的分子質(zhì)量無顯著變化，CHS在衍生過程中未發(fā)生明顯降解。根據(jù)FA分子的分子質(zhì)量及CHS-FA的標(biāo)記率進(jìn)行理論計(jì)算，F(xiàn)A的引入將增加CHS分子質(zhì)量約1.5 kDa，僅為原始CHS分子質(zhì)量的2.6%，與實(shí)際測定的結(jié)果基本吻合。

CHS中富含SO42-，屬于硫酸多糖的一種?，F(xiàn)有研究充分表明SO42-對硫酸多糖的空間結(jié)構(gòu)、物化特性（如水溶性、負(fù)電性等）以及生理調(diào)節(jié)功能等分子特征發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，SO42-的脫落可導(dǎo)致某些硫酸多糖喪失抗癌及抗凝血功能[35-36]。利用離子色譜法測得CHS的SO42-質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（22.17±2.41）%，CHS-FA的SO42-質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（22.30±1.48）%，兩者間不存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明熒光標(biāo)記過程中SO42-未發(fā)生脫落。

圖4 CHS及CHS-FA紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectra of CHS and CHS-FA

紅外光譜是確認(rèn)已知化合物結(jié)構(gòu)、比對化合物結(jié)構(gòu)信息的可靠手段。CHS及CHS-FA的紅外光譜圖，其峰形基本相同（圖4），尤其在“指紋區(qū)”即500～1 800 cm-1范圍內(nèi)，譜線基本重疊，表明CHS-FA保持了CHS的結(jié)構(gòu)特征。這一觀察結(jié)果與上述分子質(zhì)量、SO42-的對比分析結(jié)果相吻合。然而，F(xiàn)A苯環(huán)骨架在1 600 cm-1及1 500 cm-1的振動(dòng)峰（骨架伸縮振動(dòng)）等結(jié)構(gòu)特征[37]卻不明顯，可能由于FA基團(tuán)的量在CHS-FA中不占優(yōu)勢，導(dǎo)致FA的特征譜帶響應(yīng)較弱，結(jié)構(gòu)信息被多糖所掩蓋，這一現(xiàn)象與上述CHS-FA標(biāo)記度的測定結(jié)果相吻合。結(jié)構(gòu)是生物大分子展現(xiàn)特定物化特性、發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)，CHS在衍生過程中結(jié)構(gòu)特征未發(fā)生顯著變化，這有利于后續(xù)將CHS-FA應(yīng)用于CHS的生理功能、消化吸收代謝、相互作用等領(lǐng)域的研究。

2.3 環(huán)境因素對CHS-FA熒光強(qiáng)度的影響

圖5 不同pH值及NaCl濃度對CHS-FA的熒光強(qiáng)度及熒光穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Fluorescence intensity and stability of CHS-FA under different pH and NaCl concentrations

對不同pH值下CHS-FA的熒光強(qiáng)度測定結(jié)果表明，隨著溶液pH值的升高，CHS-FA的熒光強(qiáng)度逐漸增大。在中性及堿性的溶液環(huán)境中，CHS-FA展現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號（圖5A），且在7 d內(nèi)無顯著變化（圖5B）。但在酸性環(huán)境（pH≤6）中熒光強(qiáng)度相對較弱。上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的pH值對熒光素及其衍生物（FA即是一種熒光素衍生物）的影響結(jié)果相一致[38]。熒光素類化合物對pH值變化敏感，當(dāng)溶液pH值升高時(shí)，熒光素及其衍生物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，原因是熒光素及熒光素衍生物為有機(jī)弱酸，當(dāng)溶液的pH值升高，該弱酸的分子向相應(yīng)的離子型體轉(zhuǎn)化，電子構(gòu)型的改變進(jìn)而增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度[38]。

隨著NaCl濃度的升高，CHS-FA的熒光強(qiáng)度有所降低，但降低的幅度相對有限，當(dāng)溶液NaCl濃度為2 mol/L時(shí)，CHS-FA的熒光強(qiáng)度為0 mol/L NaCl下的91.0%；且在NaCl濃度小于等于1 mol/L的范圍內(nèi)，CHS-FA的熒光強(qiáng)度無顯著差別，僅存在數(shù)值上的差異。在考察的各NaCl濃度下，CHS-FA的熒光強(qiáng)度7 d內(nèi)均無顯著變化，展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。并且，與新鮮配制的CHS-FA溶液（0.01 mg/mL，溶于pH 8.0的50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液）相比，各pH值及NaCl濃度條件下放置7 d后的樣品其TLC及HPSEC-FLD-RID未發(fā)生變化，表明在各條件下，CHS-FA未發(fā)生降解。

上述結(jié)果綜合表明，CHS-FA適用于中性及堿性條件下的熒光觀察及存放，且受NaCl濃度的影響小，提示CHS-FA具有較寬的應(yīng)用范圍。

3 結(jié) 論

本研究成功實(shí)現(xiàn)了CHS的熒光標(biāo)記，證實(shí)以FA為熒光染料并配合溴化氫活化法是對CHS進(jìn)行熒光衍生的有效方式。標(biāo)記產(chǎn)物CHS-FA標(biāo)記度為4.4，其最佳熒光激發(fā)波長為495 nm、發(fā)射波長為520 nm，與FA的特征波長基本相符。分子質(zhì)量測定、SO24-質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定及傅里葉變換紅外光譜比較分析的結(jié)果表明，標(biāo)記前后多糖的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)特征未發(fā)生明顯變化。標(biāo)記產(chǎn)物在中性及堿性環(huán)境中展現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度及穩(wěn)定性，溶液環(huán)境中的NaCl對CHS-FA的影響有限。CHS熒光標(biāo)記產(chǎn)物的成功制備為今后研究CHS的吸收代謝、功能機(jī)理及分子相互作用提供了良好工具，有利于CHS的后續(xù)深入研究及進(jìn)一步開發(fā)利用。

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