miR-142-3p在結(jié)直腸癌組織與細(xì)胞中的表達(dá)及對細(xì)胞增殖影響研究*

朱文俠，楊 玲，成 鈞，楊彥玲，韓振奎，韓繼明，黃廣智，王航輝

1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院 (延安716000)， 2.西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院 (西安 710054)

miR-142-3p在結(jié)直腸癌組織與細(xì)胞中的表達(dá)及對細(xì)胞增殖影響研究*

朱文俠1，楊 玲1，成 鈞1，楊彥玲1，韓振奎1，韓繼明1，黃廣智1，王航輝2△

1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院 (延安716000)， 2.西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院 (西安 710054)

*陜西省教育廳科學(xué)研究計劃項(xiàng)目(2013JK0754)

中國博士后科研項(xiàng)目(2016M600804)

陜西省博士后科研項(xiàng)目(2016BSHEDZZ92)

西安市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研項(xiàng)目(J201602023)

西安市紅會醫(yī)院科研項(xiàng)目(YJ2014008)

西安市科技局科研項(xiàng)目[2017115FS/YX009(16)]

△通訊作者

目的：觀察微小RNA-142-3p在結(jié)直腸癌組織與細(xì)胞中的表達(dá)，及其對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。方法：通過組織原位雜交的方法，檢測miR142-3p在結(jié)直腸癌患者組織中的表達(dá)。通過Realtime-PCR檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的miR142-3p表達(dá)。構(gòu)建pSliencer 4.1-CMV-miR142-3p過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞Caco2，通過Realtime PCR檢測重組質(zhì)粒pSilencer4.1-CMV-miR142-3p載體在結(jié)直腸癌細(xì)胞系的表達(dá)情況。通過Western Blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)變化。結(jié)果：miR142-3p主要定位于細(xì)胞的胞漿，在癌組織和癌旁組織中miR142-3p的表達(dá)存在差異。miR142-3p結(jié)直腸癌細(xì)胞系中呈低表達(dá)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR142-3p可下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1，抑制細(xì)胞增殖。結(jié)論：miR142-3p抑制結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞的增殖，下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1，有望成為結(jié)直腸癌診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC )是最常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第3位，病死率居第4位，成為危害人類生命健康的重要疾病[1-6]。微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一類長18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，直接與靶基因mRNA 3'UTR結(jié)合，這可能進(jìn)一步導(dǎo)致靶mRNA的降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因進(jìn)行調(diào)控，一個microRNA可以調(diào)節(jié)許多靶基因，同時被許多基因調(diào)控。通過抑制其轉(zhuǎn)錄后水平靶基因的表達(dá)，已經(jīng)證明了miRNAs在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程(如細(xì)胞代謝、增殖、分化和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程)以及纖維化中起重要作用[7-10]。研究表明miR-142-3p與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。例如，微小RNA-142-3p在腎細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，與腎細(xì)胞癌細(xì)胞遷移，增殖和凋亡有關(guān)[11]。MicroRNA-142-3p調(diào)控Wnt信號通路并在乳腺癌的發(fā)病中扮有重要作用[12-13]。然而，miR-142-3p是否在結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用方面的研究較少，本文擬就該就此發(fā)病機(jī)制進(jìn)行如下研究。

材料與方法

1 材料與儀器 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，胎牛血清(Gibco BRL)，DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)，轉(zhuǎn)染試劑lipo-2000(Invitrogen公司)，SYBR Green試劑盒(大連Takara公司)，原位雜交檢測試劑盒(博士德公司)，hsa-miR-142-3p地高辛探針(Exiqon，18043-15)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，定量PCR儀(ABI公司7500)，紫外光密度分析儀(上海復(fù)日公司)，分光光度計(Eppendof, Hamburg, Germany)，電泳儀(Bio-Rad公司)。

2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)或K-SFM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)中，于含5% CO2和95% O2混合氣體的37 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)；根據(jù)細(xì)胞生長狀況，每2～3天傳代1次，以保持細(xì)胞處于對數(shù)生長期； 所有細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)期間全部進(jìn)行支原體檢測，結(jié)果均為陰性；經(jīng)臺盼藍(lán)染色分析細(xì)胞活力，活力均保持在90%以上。

3 組織原位雜交 組織原位雜交操作過程如下：石蠟切片60℃烤片過夜；二甲苯脫蠟至水；去離子水洗3遍；抗原修復(fù)。將片子于1%檸檬酸鈉液(pH6.0)中微波熱修復(fù)，取出后放置于100℃烤箱15min；去離子水洗3遍；3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；去離子水洗3遍；胃蛋白酶消化8 min；去離子水洗3遍；梯度酒精脫水，室溫晾干>20 min；加miR142-3p探針12.5nM/張，封口膜封片，42℃水浴過夜>10h；洗膜液(2XSSC+0.1%SDS，pH7.0)42℃洗3次，30 min /次；洗膜液(2XSSC+0.1%SDS，pH7.0)室溫?fù)u床洗3次，15 min /次；PBST(0.01%TWEEN20，pH7.4)室溫?fù)u床洗3次，5 min /次；封閉液室溫封閉20 min；生物素化鼠抗地高辛37℃孵育1h；PBST(0.01%TWEEN20，pH7.4)室溫?fù)u床洗3次，5 min /次；SABC-POD室溫孵育30 min；PBST(0.01%TWEEN20，pH7.4)室溫?fù)u床洗3次，5 min /次；DAB顯色，顯微鏡下觀察15～30s(DAB)，充分水洗，終止反應(yīng)；自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

4 實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄PCR 按照SYBR Green試劑盒說明書 (大連Takara公司) 操作。反應(yīng)體系見表1～2。每組設(shè)三個復(fù)孔，通過計算標(biāo)準(zhǔn)差來衡量實(shí)驗(yàn)誤差。反應(yīng)在專用的96孔板(MicroAmp optical 96-well)中進(jìn)行，以O(shè)ptical adhesive covers (Applied Biosystems)封口，在 ABI7500 FAST 儀器上設(shè)定兩步法 PCR擴(kuò)增程序，詳細(xì)過程如下：Stage I：95 ℃ 30 sec，循環(huán)一次；Stage II： 95 ℃ 5 sec，60 ℃ 30 sec，循環(huán) 40 次；Stage III：95 ℃ 15 sec，60 ℃ 30 sec，95 ℃ 15 sec，循環(huán) 40 次。采用ABI 7500 fast儀器附帶的軟件分析數(shù)據(jù)，計算出熒光信號超過背景熒光強(qiáng)度所對應(yīng)的閾值，即循環(huán)數(shù)Ct 值。計算目的基因與內(nèi)參β-actin的CT值之差(ΔCt)，以此來反映在等量cDNA起始反應(yīng)的情況下目的基因表達(dá)的差異。Real-Time PCR最終的結(jié)果以2-ΔΔCt表示，體現(xiàn)出實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對于內(nèi)參表達(dá)量的變化倍數(shù)，使用這一方法可以直接得到目的基因相對于管家基因的定量。

表1 142-3p引物序列表

表2 miR142-3p表達(dá)載體引物序列表

5 載體構(gòu)建 以pSliencer 4.1-CMV-puro為載體，選取BamHⅠ和HindⅢ兩個酶切位點(diǎn)，插入miR142-3p片段。總共選取兩段，一段為174bp(87bp miR142-3p前體序列+上游35堿基+下游52堿基),一段為417bp(87bp miR142-3p前體序列+上游181堿基+下游150堿基)。30l PCR反應(yīng)體系包括：3l 10×KOD buffer， 1.2l MgSO4，3l dNTP，0.5l 正向引物(10M)，0.5l反向引物(10M)，2l K562DNA 模板，1l KODase，18.8l雙蒸水補(bǔ)足30l。反應(yīng)程序按照：95 ℃5 min，重復(fù)如下循環(huán)35次：94 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min。最后72 ℃ 10 min(圖1)。

圖1 pSliencer4.1-CMV-puro載體圖譜

6 蛋白印跡 本研究中蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)的詳細(xì)操作步驟如下：用預(yù)冷的0.01 M 的PBS緩沖液(pH 7.4)潤洗細(xì)胞2次，按照細(xì)胞密度加入適量的含DTT 的2×SDS裂解液，徹底裂解細(xì)胞，并收集至EP管中，Type17600 Dri-Bath 調(diào)節(jié)溫度至95℃，95 ℃煮10 min，冰上放置10 min，重復(fù)2次，使蛋白徹底變性，再用95 ℃ 煮 10 min后，12 000 rpm，室溫離心 5min，將上清(即總蛋白)移至另一干凈的EP管中。 利用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白保存在-80℃冰箱備用，以防降解。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，以10孔板，每孔上樣10 μl蛋白樣品為例，配制蛋白上樣體系，不足的體積用2×SDS裂解液補(bǔ)足，同時加入溴酚藍(lán)示蹤。根據(jù)目的蛋白分子量大小配制8%～12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離目的蛋白。

上樣完成后，首先用電壓80 V電泳至分離膠時換電壓為120 V，直至溴酚藍(lán)示蹤條帶電泳至電泳槽底部，終止電泳。電泳結(jié)束后，取出電泳膠，在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，去除積層膠，將含有蛋白質(zhì)的分離膠安放在Western blot專用三明治式轉(zhuǎn)膜夾中，安放順序由負(fù)極至正極依次為黑板、海綿、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙、海綿和白板。轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)法，恒流 300 mA或恒壓100 V，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白質(zhì)分子量設(shè)定為 1 h 40 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，注意與分離膠接觸的一面朝上，用TBST將PVDF膜漂洗1次，經(jīng)麗春紅染色評估蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜以及蛋白定量的情況，然后用TBST漂洗PVDF膜3次，每次5 min，充分洗滌直至將麗春紅染色洗凈。將PVDF膜孵育在TBST配制的5%的脫脂奶粉中，室溫 1 h，以封閉PVDF膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜孵育在TBST配制的目的蛋白的相應(yīng)一抗中，室溫 1 至 2 h 或4 ℃ 孵育過夜。TBST漂洗PVDF膜3 次，室溫，每次10 min，再將PVDF膜孵育在相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中，室溫 1 h。TBST漂洗PVDF膜3次，室溫，每次10 min?？乖贵w復(fù)合物用Immobilon Western Chemilminescent HRP Substrate試劑進(jìn)行顯影，在Fluor Chem E掃膜儀器上檢測蛋白表達(dá)情況并曝光存圖。

7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。正態(tài)分布的兩組組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的兩組組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；率的比較采用卡方檢驗(yàn)和確切概率法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR142-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào) 對20例結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織樣本和20例癌旁組織通過組織原位雜交的方法，檢測miR142-3p的表達(dá)及定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR142-3p成熟體主要定位于細(xì)胞的胞漿，根據(jù)miR142-3p表達(dá)的強(qiáng)弱，主要判斷標(biāo)準(zhǔn)是按照原位雜交染色的強(qiáng)度分為三個等級，陰性(-)、弱陽性(+)和強(qiáng)陽性()，在20例癌組織中miR142-3p陽性表達(dá)9例(45%)，其中弱陽性表達(dá)7例(35%)，強(qiáng)陽性表達(dá)2例(10%)；在20例癌旁組織中miR142-3p陽性表達(dá)18例(90%)，其中弱陽性表達(dá)2例(10%)，強(qiáng)陽性表達(dá)16例(80%)，說明在癌組織和癌旁組織中miR142-3p的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值<0.01,圖2)。

A:組織原位雜交檢測hsa-miR142-3p成熟體在各種類型結(jié)腸病變的表達(dá)情況(正常粘膜上皮、高分化腺癌、低分化腺癌和粘液癌)；B:比較hsa-miR142-3p成熟體在結(jié)直腸癌患者癌旁組織和癌組織表達(dá)的差異(癌旁組織n=20例，癌組織n=20例);表達(dá)強(qiáng)度分別記為陰性(-)、弱陽性(+)和強(qiáng)陽性()，*P<0.01

圖2 結(jié)直腸癌組織hsa-miR142-3p的表達(dá)

2 miR142-3p結(jié)直腸癌細(xì)胞系中呈低表達(dá) 通過Realtime-PCR檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW1116、Caco2、HCT-116、Lv-174T中的miR142-3p表達(dá)含量(K562細(xì)胞作為陽性對照)，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR142-3p的表達(dá)量很低(圖3)。

3 結(jié)直腸癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR142-3p下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，抑制細(xì)胞增殖 將miR142-3p的表達(dá)載體(417bp)在結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco2中瞬時過表達(dá)，48 h后細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)外源性miR142-3p的這組細(xì)胞與對照組相比增殖速度明顯減慢，說明外源性的miR142-3p能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞Caco2的增殖。同時Western Blot檢測蛋白發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)外源性miR142-3p 48 h后能夠使細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1在蛋白水平表達(dá)下降(圖4)。

圖3 結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR142-3p的表達(dá)

A:從K562基因組DNA中分別克隆長174bp和417bp的miR142-3p片段，構(gòu)建到miRNA的表達(dá)載體pSilencer4.1-CMV，通過Realtime PCR檢測重組質(zhì)粒pSilencer4.1-CMV-miR142-3p載體在結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW1116的表達(dá)情況；B:在結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco2中瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒miR142-3p 417，pSilencer4.1-CMV作為陰性對照，48 h后細(xì)胞計數(shù)評價細(xì)胞增殖情況；C:在結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco2中瞬時轉(zhuǎn)染miR142-3p表達(dá)載體miR142-3p 417片段，pSilencer4.1-CMV作為陰性對照，48 h后通過Western Blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)變化

圖4 過表達(dá)miR142-3p能夠抑制細(xì)胞增殖

討 論

miRNAs在細(xì)胞的生長 、分化 、增殖 、發(fā)育 、凋亡和代謝等多種過程中發(fā)揮著重要作用 ，miRNAs表達(dá)的失衡會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，miRNAs 與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)在正常結(jié)直腸癌旁組織的粘膜中miR142-3p高表達(dá)，癌組織中表達(dá)減少，并且隨著腫瘤分化程度的降低，miR142-3p的表達(dá)也隨之減少。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR142-3p的表達(dá)下調(diào)。過表達(dá)miR142-3p能抑制結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞的增值。Zhang等[22]將miRNA-143靶向作用于MACC1的3UTR，下調(diào) MACC1表達(dá)； 提示 miRNA-143可能直接作用于其靶分子MACC1，抑制癌細(xì)胞侵襲。BOL等[23]發(fā)現(xiàn)在CRC細(xì)胞系和組織樣本中miRNA-152表達(dá)下調(diào)；恢復(fù)CRC細(xì)胞中miRNA-152表達(dá)后，CRC細(xì)胞增殖、遷移和入侵顯著減少； PIK3R3是miRNA-152直接和功能性下游靶目標(biāo)，PIK3R3表達(dá)和miRNA-152表 達(dá)呈負(fù)相關(guān)；下調(diào)PIK3R3表達(dá)使miRNA-152超表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長。另有研究表明[24-28]，一部分miRNAs在腫瘤中呈高表達(dá)。我們的研究與BOL等的研究獲得了相似的結(jié)果，我們推測miR142-3p與miRNA-152等一部分miRNAs在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起負(fù)性調(diào)控，另外一部分miRNAs起正性調(diào)控作用，如何精準(zhǔn)調(diào)控？有待于進(jìn)一步研究。

如何特異性地將 miRNA的激活劑及抑制劑引入腫瘤細(xì)胞，以及如何利用 miRNA的表達(dá)譜為早期結(jié)直腸癌提供診斷和治療依據(jù)[29-33]，將是我們面臨的挑戰(zhàn)與機(jī)遇。

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(收稿：2017-09-18)

TheexpressionofmiR-142-3pincolorectalcanceranditseffectonproliferation

Zhu Wenxia，Yang Ling，Cheng Jun,et al.

Medical College of Yan’an University(Yan’an 716000)

Objective: To observe the expression of microRNA-142-3p in colorectal cancer and its effect on the proliferation of human colorectal cancer cells. Methods: The expression of miR142-3p in the tissues of colorectal cancer was detected by in situ hybridization. The expression of miR142-3p in colorectal cancer cell lines was detected by Realtime-PCR. Construction of pSliencer 4.1-CMV-miR142-3p overexpressing vector, the colorectal cancer cells Caco2 was transfected. The expression of recombinant plasmid pSilencer4.1-CMV-miR142-3p vector in colorectal cancer cell lines was detected by Realtime PCR. The expression of CyclinD1 was detected by Western Blot. Results: miR142-3p was mainly located in the cytoplasm of cells, The expression of miR142-3p was different in cancer tissues and adjacent tissues. The expression of miR142-3p in colorectal cancer cell lines was low. Overexpression of miR142-3p in colorectal cancer cell lines may down-regulate the expression of cell cycle-associated protein CyclinD1, which inhibit cell proliferation. Conclusion: miR142-3p can inhibits the proliferation of colorectal cancer CAGE2 cells and down-regulation the expression of CyclinD1 and is expected to be a potential target for the diagnosis and treatment of colorectal cancer.

Colorectal neoplasms/physipathology @MicroRNA 142-3p Proliferation

結(jié)直腸腫瘤/病理生理學(xué) @微小分子142-3p 增殖

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.003