醫(yī)療器械與血液相互作用試驗(yàn)
——體外血小板計(jì)數(shù)新方法的建立

喬春霞 侯麗 趙增琳 屈秋錦 褚祥宇 董傳俊 魏振西 展榮凱

1 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 （山東 濟(jì)南 250101）

2 山東恒信檢測(cè)技術(shù)開發(fā)中心 （山東 濟(jì)南 250101）

ISO10993.4/GB/T16886.4[1]指出與血液接觸的醫(yī)療器械進(jìn)行血液相容性評(píng)價(jià)時(shí)，需要對(duì)一些器械對(duì)血小板和血小板功能的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。ISO 10993-4:2017（E）[2]中對(duì)血小板激活試驗(yàn)的選擇進(jìn)行了調(diào)整，推薦試驗(yàn)為血小板計(jì)數(shù)和激活指示劑的測(cè)定或血小板形態(tài)學(xué)測(cè)定。針對(duì)血小板計(jì)數(shù)的具體檢測(cè)方法，目前可參考的標(biāo)準(zhǔn)是ASTM F2888-2013[3]，此標(biāo)準(zhǔn)中采用的體外血小板計(jì)數(shù)方法是采用枸櫞酸鈉的抗凝人全血進(jìn)行的，推薦的陽(yáng)性對(duì)照材料是黑橡膠和天然膠乳，要求與材料接觸后的全血中的血小板計(jì)數(shù)值要小于空白全血血小板計(jì)數(shù)值的50%。但是經(jīng)過筆者選用多種黑橡膠和天然膠乳試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在此試驗(yàn)體系下，黑橡膠和天然膠乳對(duì)于全血中血小板計(jì)數(shù)值的影響并不能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。因此對(duì)ASTM F2888-2013的試驗(yàn)體系進(jìn)行了改進(jìn)，選擇幾種容易獲得的材料用于篩選符合要求的陽(yáng)性對(duì)照材料，為能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)醫(yī)療器械血小板性能評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支持。

1.材料、試劑和儀器

1.1 材料

陰性對(duì)照：聚乙烯（日本HRI）；陽(yáng)性對(duì)照：黑橡膠（Fisher Scienti fi c）；玻璃珠（Sigma）；丁腈手套（石家莊鴻瑞集團(tuán)）；橡膠手套（詩(shī)董橡膠股份有限公司）。

1.2 試劑

檸檬酸鈉抗凝的采血管（3.2%，0.109M，上海科華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；EDTA二鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），配制成500mmol/L濃度；氯化鈣（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），配制成1M濃度；肝素鈉（Sigma），配制成200U/mL。

1.3 儀器

本試驗(yàn)使用的儀器主要有水浴搖床（1092型，德國(guó)GFL公司），全自動(dòng)血液分析儀（日本株式會(huì)社，XT-2000i型）。

2.方法

2.1 制備樣品

試驗(yàn)分為4組，每組有5種材料，每種材料平行制備3管，每管12cm2。將材料剪成小塊置于聚丙烯試管中，以保證能與1mL血液最大程度接觸。每組平行制備3管未接觸材料的全血作為空白對(duì)照。同時(shí)，為了研究試驗(yàn)體系的穩(wěn)定性，本研究重復(fù)進(jìn)行了3次試驗(yàn)。

2.2 試驗(yàn)前準(zhǔn)備

靜脈采集新鮮人全血，枸櫞酸鈉抗凝，混勻后置于冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 試驗(yàn)步驟

枸櫞酸鈉抗凝全血組：每支試管中加入0.9%氯化鈉注射液預(yù)濕試管中的樣品，室溫靜置30s，移除所有0.9%氯化鈉注射液后，每支試管中加入全血1mL。

含枸櫞酸鈉、氯化鈣和肝素鈉溶液全血組：將剩余的全血分為3組，按每1mL血液中加入0.01mL氯化鈣溶液的比例，在抗凝全血中加入氯化鈣溶液，使其終濃度為10mmol/L。每組全血分別加入適量的200U/mL的肝素鈉溶液，使其終濃度分別為0.5U/mL、1.0U/mL和2.0U/mL。按上文步驟每支試管中加入調(diào)整后的全血。

所 有 試 管 在（37±1）?C的 水 浴 中 震 蕩 孵 育（60±5）min，轉(zhuǎn)速為60rpm。孵育后，每支試管中加入EDTA（500mmol/L）0.01mL，使其終濃度為5mmol/L來終止反應(yīng)。用血液分析儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。

2.4 結(jié)果計(jì)算

分別計(jì)算3管陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照的血小板計(jì)數(shù)平均值。按下式計(jì)算陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照與空白對(duì)照相比的百分比：

式中：A=陰性對(duì)照/陽(yáng)性對(duì)照血小板計(jì)數(shù)平均值，B=空白對(duì)照的血小板計(jì)數(shù)平均值，C=與空白對(duì)照相比的百分比（%）。

2.5 試驗(yàn)有效性

空白對(duì)照組血液應(yīng)在正常成人血小板計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，即（100～300）×109/L范圍內(nèi)。

空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照3個(gè)讀數(shù)的每一個(gè)值應(yīng)在（讀數(shù)均值±20%）區(qū)間內(nèi)。

陰性對(duì)照的血小板讀數(shù)的接受準(zhǔn)則為空白對(duì)照的80%～120%范圍內(nèi)。陽(yáng)性對(duì)照的血小板值與空白對(duì)照相比的百分?jǐn)?shù)值應(yīng)小于50%。

3.結(jié)果

空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的3個(gè)讀數(shù)的每一個(gè)值均在（讀數(shù)均值±20%）區(qū)間內(nèi)。

3次試驗(yàn)空白對(duì)照組血小板計(jì)數(shù)值均在正常成人血小板計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，即（100～300）×109/L。

陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照與空白對(duì)照相比的百分比見圖1、圖2和圖3。枸櫞酸鈉抗凝全血組血小板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示所有的陽(yáng)性對(duì)照材料血小板計(jì)數(shù)值均大于空白對(duì)照的50%，因此該試驗(yàn)體系不能滿足檢測(cè)要求。

圖1. 第一次試驗(yàn)結(jié)果（C值，%）

圖2. 第二次試驗(yàn)結(jié)果（C值，%）

圖3. 第三次試驗(yàn)結(jié)果（C值，%）

加入氯化鈣和肝素鈉溶液后的全血與材料接觸后3次試驗(yàn)結(jié)果顯示：

肝素鈉濃度為0.5U/mL時(shí)，除了第三次試驗(yàn)的陰性對(duì)照血小板計(jì)數(shù)值為空白對(duì)照93.7%外，其余試驗(yàn)所有試管均發(fā)生凝血。按照上文的判斷依據(jù)，第三次試驗(yàn)符合要求。

肝素鈉濃度為1.0U/mL時(shí)，按照上文的判斷依據(jù)，陰性對(duì)照符合要求。三次試驗(yàn)黑橡膠的血小板計(jì)數(shù)值均低于空白對(duì)照的50%。丁腈手套和玻璃珠在第一次和第二次試驗(yàn)中符合要求。橡膠手套在三次試驗(yàn)中均降低但沒有超過空白對(duì)照的50%。因此黑橡膠符合陽(yáng)性對(duì)照的要求，而其他陽(yáng)性材料則反應(yīng)不一致。

肝素鈉濃度為2.0U/mL時(shí)，按照上文的判斷依據(jù)，陰性對(duì)照符合要求。只有黑橡膠在第一次和第三次試驗(yàn)時(shí)符合要求。其他材料的小板計(jì)數(shù)值降低均不明顯。綜合判斷，肝素鈉濃度為2.0U/mL時(shí)，不適宜用于檢測(cè)接觸醫(yī)療器械后全血的血小板計(jì)數(shù)。

4.討論

體外檢測(cè)血小板激活需要考慮兩個(gè)重要的問題：減少自發(fā)的血小板激活需要采用靜脈穿刺采血，血液需抗凝防止凝血，同時(shí)要保持血小板的活化狀態(tài)直至檢測(cè)[4]。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，不同的抗凝劑對(duì)血小板數(shù)量及血小板功能的檢測(cè)有不同的影響[5-8]。按照ASTM F2888-2013的要求，血小板計(jì)數(shù)采用的體系是枸櫞酸鈉抗凝的人全血，許多研究者也優(yōu)先采用枸櫞酸鈉抗凝的全血進(jìn)行血小板研究，主要是因?yàn)殍蹤此徕c同EDTA相比能較少引起血小板的自發(fā)激活[5]。本研究發(fā)現(xiàn)按照此標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)體系，與陽(yáng)性對(duì)照材料接觸后的血液中的血小板數(shù)量沒有明顯減少，因此，不適用于進(jìn)行醫(yī)療器械與血小板相互作用的評(píng)價(jià)。在此試驗(yàn)體系的基礎(chǔ)上，本次研究對(duì)試驗(yàn)體系進(jìn)行了改進(jìn)，使血液處于輕度抗凝狀態(tài)，利于血小板的激活。

本研究發(fā)現(xiàn)采用相同的試驗(yàn)材料在不同的時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)得到的肝素鈉的最佳濃度不同，可能的原因是血液不同，保存期限內(nèi)的試劑濃度的變化等。有研究證實(shí)，在血液中加入一些試劑可以使血小板的物理和生化狀態(tài)保持在某一特殊時(shí)間點(diǎn)，從而減少血小板的自發(fā)激活，接觸后的血液可以放置較長(zhǎng)時(shí)間[4,6,9,10]。本試驗(yàn)中的EDTA即具有終止反應(yīng)的作用。血小板的消耗通常受到血液接觸表面積的影響，因此醫(yī)療器械的表面積會(huì)影響血小板計(jì)數(shù)的結(jié)果。為了使試驗(yàn)樣品的結(jié)果與對(duì)照相比具有最大差異化，本研究與ASTM F2888-2013保持一致，醫(yī)療器械表面積與血液體積的比例為12cm2:1mL。

盡管本研究建立的試驗(yàn)體系還存在著一些缺陷，但總的來說適用于體外測(cè)試醫(yī)療器械與血小板間的相互作用，黑橡膠可以作為陽(yáng)性對(duì)照用于檢測(cè)。醫(yī)療器械對(duì)血小板的影響，除計(jì)數(shù)外還需要考慮其他方面如材料表面黏附、激活和血小板表面活化分子表達(dá)等，此體系是否適用于這些檢測(cè)，還需要進(jìn)一步研究。另外，因?yàn)槿搜獊碓从邢?，兔血是否使用于此體系，也是下一步需要研究的內(nèi)容。

[1] GB/T16886.4-2003:《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第4部分:與血液相互作用試驗(yàn)選擇》[S].2003-08-13.

[2] ISO 10993-4:2017 (E):Biological evaluation of medical devices––Part 4:Selection of tests for interactions with blood[S].2017-4.

[3] ASTM F2888-2013:Standard Test Method for Platelet Leukocyte Count- An In-Vitro Measure for Hemocompatibility Assessment of Cardiovascular Materials[S].2013.

[4] Macey M, Azam U, McCarthy D, et al. Evaluation of the anticoagulants EDTA and citrate, theophylline, adenosine, and dipyridamole( CTAD) for assessing platelet activation on the ADVIA 120 hematology system[J].Clin Chem.,2002,48(6 Pt 1):891-899.

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