兩種心肌纖維化動(dòng)物模型基本情況比較

徐為民，孫 志，陳 歡，時(shí)景偉

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033)

心肌纖維化動(dòng)物模型在心血管疾病基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中占有重要地位，目前較常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌纖維化造模方法有：自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化、糖尿病大鼠心肌纖維化、二腎一夾及腎下主動(dòng)脈縮窄模型、腹主動(dòng)脈縮窄法等，其中主動(dòng)脈縮窄法是近幾年較為主流的心肌纖維化及心衰造模方法，本文將主動(dòng)脈縮窄法與經(jīng)典的異丙腎上腺素法作一簡(jiǎn)單比較，初步探討兩者的優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物BALB/c雄性SPF級(jí)小鼠40只，體重17-24 g，約8周齡，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2試劑與儀器鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海豐禾制藥有限生公司生產(chǎn))，異氟烷(德國(guó)費(fèi)森尤斯公司生產(chǎn))，小動(dòng)物麻醉系統(tǒng)(加拿大Visualsonics公司)，小動(dòng)物超聲(加拿大Visualsonics公司)。羊抗小鼠UII(尾加壓素Ⅱ)單克隆抗體、羊抗小鼠GPR14(尾加壓素受體)多克隆抗體(由Santa Cruz公司提供)； SP-免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(由北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司提供)等。

1.3造模40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、異丙腎組、sham組和TAC組。異丙腎組腹部皮下注射Iso10 mg/kg，每天1次，正常對(duì)照組，每天皮下注射生理鹽水，TAC組于異氟烷麻醉下行胸切口，主動(dòng)脈弓瞬時(shí)夾閉手術(shù)，Sham組只行開(kāi)胸及縫合，不做主動(dòng)脈弓夾閉。至1周時(shí)，每組隨機(jī)取5只，行心臟彩超后摘取心臟進(jìn)行染色。至3周時(shí)，同樣處置。

1.4心臟彩超將小鼠置于加熱板上保持體溫恒定，適當(dāng)調(diào)整超聲探頭以獲取胸骨旁長(zhǎng)軸圖像，測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)，左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)。

1.5方法HE、天狼星紅染色，按常規(guī)染色法進(jìn)行操作。免疫組織化學(xué)染色按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。 染色后在每張切片左心室尖部隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×200)，用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)所選視野內(nèi)陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的各組小鼠心肌組織陽(yáng)性信號(hào)吸光度(A)。

2 結(jié)果

2.1一般情況正常對(duì)照組及sham組小鼠一般狀態(tài)佳，行為敏捷，皮毛光滑茂盛。異丙腎組3天時(shí)死亡1只，3周時(shí)死亡一只，其余8只精神萎糜，有明顯掉毛，行為遲緩，食欲明顯減退。TAC組手術(shù)時(shí)死亡1只，術(shù)后24小時(shí)死亡一只，其余8只精神略萎糜，輕度掉毛，活動(dòng)度較異丙腎組略好。Sham組手術(shù)時(shí)死亡一只，其余9只活動(dòng)度及食欲均良好。

2.2心臟彩超異丙腎組造模1周時(shí)只有左室舒張末期內(nèi)徑明顯增大，左室射血分?jǐn)?shù)明顯下降，而3周時(shí)四項(xiàng)指標(biāo)均明顯變化。而主動(dòng)脈縮窄組在一周時(shí)只表現(xiàn)為左室射血分?jǐn)?shù)下降，至三周時(shí)四項(xiàng)指標(biāo)也出現(xiàn)顯著變化。異丙腎組和TAC組在第一周的指標(biāo)變化沒(méi)有差距，而在第三周時(shí)均出現(xiàn)明顯差別。見(jiàn)表1。

2.3HE染色1周時(shí)正常對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，橫紋清晰，胞核染色明顯，無(wú)細(xì)胞腫脹。Sham組基本同正常對(duì)照組。異丙腎組則出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大，排列疏松紊亂，大小不一，細(xì)胞核大小不一，肌纖維增粗，散在壞死灶，部分區(qū)域肌纖維完全溶解，核異質(zhì)性明顯，心肌間質(zhì)可見(jiàn)纖維組織增生。TAC組也出現(xiàn)上述改變，但程度較輕，見(jiàn)圖1。3周時(shí)，正常對(duì)照組與Sham組無(wú)明顯變化。異丙腎組壞死病灶面積增大，病灶內(nèi)出現(xiàn)較多纖維化，壞死程度明顯比1周時(shí)增大。TAC組壞死程度及纖維化程度較1周時(shí)明顯加重，但較異丙腎組為輕。見(jiàn)圖2。

**與正常對(duì)照組比較，P<0.01.##與sham組比較，P<0.01.&與異丙腎組比較，P<0.05.&&與異丙腎組比較，P<0.01

圖1 1周時(shí)各組心肌HE染色，A正常對(duì)照組，B 異丙腎組，C sham組，D TAC組

圖2 3周時(shí)各組心肌HE染色，A正常對(duì)照組，B 異丙腎組，C sham組，D TAC組

2.4天狼星紅染色1周時(shí)正常對(duì)照組心肌膠原表達(dá)較少，Sham組亦較少，異丙腎組膠原纖維組織輕度增生，心內(nèi)膜下、間質(zhì)中膠原沉積量輕度增加，TAC組無(wú)明顯增加。見(jiàn)圖3。3周時(shí)正常對(duì)照組與Sham組均無(wú)明顯變化，異丙腎組膠原明顯增加，TAC組也明顯增加，但較異丙腎組為輕。見(jiàn)圖4。

圖3 1周時(shí)各組心肌天狼星紅染色 A正常對(duì)照組，B 異丙腎組，C sham組，D TAC組

圖4 3周時(shí)各組心肌天狼星紅染色 A正常對(duì)照組，B 異丙腎組，C sham組，D TAC組

2.5UII及UT蛋白表達(dá)情況UII免疫組織化學(xué)染色顯示：正常對(duì)照組及sham組在心尖及心內(nèi)膜可見(jiàn)極少量陽(yáng)性表達(dá)的心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，且不隨時(shí)間延長(zhǎng)而改變。1周后，異丙腎組及TAC組UII陽(yáng)性產(chǎn)物即明顯增加，呈黃褐色(P<0.01)，3周后，這兩組UII陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)明顯比1周多(P<0.01)，且陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在壞死灶周?chē)?。UT免疫組化染色結(jié)果與UII同步。見(jiàn)圖5-8、表1。

圖5 1周時(shí)UII染色 A正常對(duì)照組，B異丙腎組，C TAC組，D sham組

圖6 1周時(shí)UT染色 A正常對(duì)照組，B異丙腎組，C TAC組，D sham組

圖7 3周時(shí)UII染色 A正常對(duì)照組，B異丙腎組，C TAC組，D sham組

圖8 3周時(shí)UT染色 A正常對(duì)照組，B異丙腎組，C TAC組，D sham組

組別正常對(duì)照組(n=10)1周(n=5)3周(n=5)異丙腎組(n=8)1周(n=4)3周(n=4)Sham組(n=9)1周(n=4)3周(n=5)TAC組(n=8)1周(n=3)3周(n=5)UⅡ(A*103)2.63±0.242.74±0.1815.78±2.96**16.81±3.12**2.76±0.182.81±0.216.27±0.70##13.56±2.24##UT(A*103)2.8±0.82.9±1.015.9±4.1**17.9±3.9**2.9±0.73.0±0.87.5±1.2##14.6±3.1##

**與正常對(duì)照組比較P<0.01.##與sham組比較P<0.01.

3 討論

異丙腎上腺素使小鼠心率加快，心率持續(xù)強(qiáng)烈收縮，心肌因相對(duì)缺血導(dǎo)致壞死及纖維化，出現(xiàn)心臟功能衰竭[1]。而主動(dòng)脈縮窄法造成心臟壓力負(fù)荷增加，心肌逐漸肥厚、重塑，最終造成心功能惡化[2]。

本研究首次將此兩種方法進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)HE和天狼星紅染色結(jié)果可以看出，在同樣的周期下，異丙腎上腺素法致心肌纖維化程度較主動(dòng)脈縮窄法高，這可能與異丙腎上腺素的劑量變異性較大有關(guān)[3,4]，也可能由于心肌缺血和高血壓導(dǎo)致心肌纖維化的機(jī)制略有不同[5]。具體原因尚待進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)的心臟彩超結(jié)果提示，異丙腎組對(duì)心臟功能的影響出現(xiàn)較早且較顯著，這與其他學(xué)者的研究相當(dāng)[6]，而主動(dòng)脈縮窄法對(duì)心臟形態(tài)和功能的影響在3周時(shí)均不明顯。根據(jù)其他研究團(tuán)隊(duì)的結(jié)論，TAC法需要4-6周才能出現(xiàn)對(duì)左室大小、EF和FS的顯著影響[2]。

在本研究中，TAC組的死亡率與ISO組相當(dāng)，TAC組與sham組死亡小鼠主要死于術(shù)中及術(shù)后并發(fā)癥，提示TAC的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高，技術(shù)難度大，但I(xiàn)SO組對(duì)小鼠機(jī)體損傷更大。此結(jié)論尚需大例數(shù)試驗(yàn)證實(shí)。

心肌纖維化(MF)主要表現(xiàn)為心肌膠原濃度顯著升高，涉及RAAS(腎素-血管緊張素-醛固酮)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)參與，多種細(xì)胞因子、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)均與MF發(fā)生有關(guān)[7]。兩組均出現(xiàn)UII及UT的蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明在心肌缺血及高血壓導(dǎo)致的心肌纖維化機(jī)制中，均有尾加壓素Ⅱ及其受體的參與，這已在多個(gè)研究中被證明[8-11]。

綜上所述，異丙腎造模法造模速度快、周期短、技術(shù)難度低，但造模過(guò)程中小鼠死亡率較高，可作為急性心肌纖維化研究模型。而主動(dòng)脈縮窄法雖然技術(shù)要求高、造模速度慢，但致死率相對(duì)略低，適宜作為慢性心肌纖維化模型進(jìn)行試驗(yàn)。

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