SAS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激時人卵巢癌順鉑敏感細胞與耐藥細胞死亡方式的差異

高瑋男，張雪雙，孫連坤，于春艷*，劉亞男*

(1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系)

Bcl2抑制劑ABT737能夠誘導(dǎo)SKOV3/DDP細胞發(fā)生凋亡，但不能完全抑制SKOV3/DDP 細胞增殖[1]，提示耐藥細胞不僅存在凋亡逃逸，還有可能存在其他形式的細胞死亡。氧化應(yīng)激時產(chǎn)生的ROS(reactive oxygen species)可能是細胞凋亡(apoptosis)、鐵死亡(ferroptosis)以及程序性壞死(necroptosis)的重要傳播者和執(zhí)行者[2-4]。然而根據(jù)細胞的狀態(tài)和誘導(dǎo)的條件不同，ROS介導(dǎo)何種細胞死亡方式目前尚不清楚。本研究利用SAS(柳氮磺吡啶)，谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運體(glutamate/cystine antiporter,xc-)抑制劑，導(dǎo)致細胞內(nèi)氧化應(yīng)激，旨在觀察在氧化應(yīng)激條件下，卵巢癌親本細胞SKOV3和耐藥細胞SKOV3/DDP能否發(fā)生程序性壞死、鐵死亡等非凋亡性細胞死亡途徑，同時對比兩種細胞死亡途徑的差異，為尋找卵巢癌耐藥的分子機制提供實驗依據(jù)和研究靶點。

1 材料與方法

1.1藥品、主要試劑和儀器IMDM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶產(chǎn)自美國 Hy Clone 公司；1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清產(chǎn)自美國 Gibco 公司；細胞培養(yǎng)板產(chǎn)自 Corning 公司；細胞培養(yǎng)皿產(chǎn)自Thermo公司；0.22 μm 濾膜、產(chǎn)自美國 Invitrogen 公司；Sulfasalazine (SAS)、MTT、壞死抑制劑Nec-1、鐵死亡抑制劑Fer-1產(chǎn)自美國 Sigma公司。RTCA DP(Real time cell analysis)來自美國羅氏公司。MLKL及磷酸化MLKL抗體購自Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng)及分組卵巢癌SKOV3、SKOV3/DDP細胞系均來自吉林大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)系研究室。卵巢癌SKOV3細胞用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；卵巢癌SKOV3/DDP細胞在培養(yǎng)皿中，含有10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)，卵巢癌SKOV3/DDP細胞每次傳代前加入1 μg/ml順鉑，以維持卵巢癌SKOV3/DDP細胞的耐藥性。細胞置于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)培養(yǎng)，隔2-3d傳代1次，接種后24 h于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。實驗分組為對照組(Con)，SAS各劑量組。 應(yīng)用鐵死亡抑制劑Fer-1，實驗分組為對照組，SAS組，F(xiàn)er-1組，F(xiàn)er-1與SAS聯(lián)合作用組。應(yīng)用程序性壞死抑制劑Nec-1，實驗分組為對照組，SAS組，Nec-1組，Nec-1與SAS聯(lián)合作用組。

1.3MTT法測定細胞增殖抑制率SKOV3和SKOV3/DDP細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組細胞5復(fù)孔，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入10 μl的MTT，培養(yǎng)結(jié)束后吸出去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩混勻15 min，使結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處測定其吸光度(A)值。對照組細胞增殖抑制率為0%，其余各組細胞增殖抑制率=(對照組A值-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4RTCA實時無標記細胞功能分析法實時連續(xù)分析細胞

先用培養(yǎng)液調(diào)零，然后按照每孔100 μl的培養(yǎng)液中含有8×103～1.5×104個細胞的濃度接種至金孔板，將金孔板嵌入RTCA的連接儀器，然后在37℃，含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細胞長至對數(shù)生長期時，將原液棄掉，加入配置好的藥物，再將金孔板嵌入RTCA的連接儀器，然后在37℃，含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細胞的實時生長曲線，當(dāng)細胞的生長曲線達到要求時，結(jié)束培養(yǎng)，并利用RTCA Data Analysis Software 1.0軟件分析結(jié)果。

1.5Westernblotting法檢測細胞中MLKL和磷酸化MLKL蛋白表達用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，以β-actin的水平作為等量蛋白質(zhì)上樣對照，取50 μg蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；5%奶粉室溫封閉2 h后，用含0.01% Tween20的TBS緩沖液漂洗3次，每次10 min；加入相應(yīng)的抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000)，37℃搖床溫育2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；DAB顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，同時以β-actin為內(nèi)參照，進行蛋白表達分析，蛋白表達水平以吸光度(A)值的比值表示，按照下列公式計算蛋白表達水平，并進行統(tǒng)計分析。蛋白表達水平=每個樣本條帶的A值/β-actin的A值。

2 結(jié)果

2.1SAS對SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，與對照組(Con)比較，不同濃度SAS作用 SKOV3細胞和SKOV3/DDP細胞，細胞生存率均降低(P<0.05)；與SKOV3細胞比較，相同濃度的SAS作用SKOV3/DDP細胞，細胞生存率降低程度不明顯，表明SKOV3 和SKOV3/DDP細胞對SAS的敏感性不同，SKOV3/DDP細胞對SAS耐受。其中，0.5 mM SAS作用SKOV3細胞，細胞生存率為(80±3)%，SAS 2 mM作用SKOV3/DDP細胞，細胞生存率為(80±4)%，這兩個劑量作為后續(xù)實驗所用劑量。見圖1。

圖1不同濃度SAS對SKOV3、SKOV3/DDP細胞生存率的影響n=3，*和#：comparedwithSASgroup

2.2MTT法檢測鐵死亡抑制劑Fer-1對SAS抑制SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響

SKOV3 MTT結(jié)果顯示，與對照組(Con)比較，SAS作用SKOV3細胞組生存率為(79.5±1.1)%；與SAS 0.5 mM組比較，F(xiàn)er-1各個濃度與SAS聯(lián)合作用24 h組SKOV3生存率沒有增加(P>0.05)；與對照組比較，不同濃度的Fer-1組生存率沒有差異(P>0.05)。見圖2。

SKOV3/DDP MTT結(jié)果顯示，與對照組(Con)比較，SAS生存為(78.9±1.6)%。與SAS 2mM組比較，F(xiàn)er-1 1.0 μM和2.0 μM與SAS 2 mM聯(lián)合作用，SKOV3/DDP細胞生存率增加(P<0.05)。與Con組比較，單獨Fer-1各濃度組細胞生存率沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.3RTCA法檢測鐵死亡抑制劑Fer-1對SAS抑制SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響

圖2MTT法檢測不同濃度Fer-1與SAS對SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響(n=3)

SKOV3細胞RTCA法結(jié)果顯示，與對照組(Con)比較，SAS 0.5 mM作用SKOV3細胞生存率曲線降低；與SAS組比較，F(xiàn)er-1各個濃度與SAS聯(lián)合24 h SKOV3生存率曲線降低。見圖3。

SKOV3/DDP細胞RTCA法結(jié)果顯示，與對照組(Con)比較，SAS 2 mM組生存率曲線降低，與SAS 2 mM組比較，F(xiàn)er-1 1.0 μM和2.0 μM與SAS 2 mM聯(lián)合作用僅在24 h前，SKOV3/DDP細胞生存率曲線升高(P<0.05)。表明Fer-1作用24 h前能挽救SAS對SKOV3/DDP細胞生存率的抑制作用。見圖3。

圖3RTCA法檢測Fer-1與SAS聯(lián)合作用對SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響(n=3)

2.4RTCA法檢測程序性壞死抑制劑Nec-1對SAS抑制SKOV3和SKOV3/DDP生存率的影響

SKOV3細胞RTCA結(jié)果顯示，與對照組(Con)比較，SAS 0.5 mM生存率曲線降低，與SAS 0.5 mM組比較，Nec-1 25 μM與SAS聯(lián)合作用組，隨著作用時間延長SKOV3細胞生存率曲線均低于SAS組的生存率曲線(P>0.05)。SKOV3/DDP細胞RTCA結(jié)果顯示，Nec-1 5 μM與SAS 2 mM聯(lián)合作用持續(xù)36 h，SKOV3/DDP細胞生存率曲線高于SAS組的生存率曲線，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4RTCA法檢測Nec-125μM與SAS聯(lián)合作用對SKOV3和SKOV3/DDP細胞生存率的影響(n=3)

2.5Westernblotting法檢測程序性壞死標志蛋白的表達水平

Western bloting結(jié)果顯示在SAS作用卵巢癌SKOV3/DDP細胞12 h、24 h時，程序性壞死相關(guān)標志蛋白磷酸化MLKL蛋白(P-MLKL)表達增加(P<0.05)；而在SAS作用卵巢癌SKOV3細胞的各個時間點，P-MLKL表達沒有變化(P>0.05)。

3 討論

耐受順鉑是卵巢癌治療的瓶頸。盡管凋亡的誘導(dǎo)是最為廣泛使用的抗腫瘤策略，但由于化療藥物往往存在廣泛的凋亡缺陷、多藥耐藥等難以克服的問題，研究程序性壞死(necroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)等非凋亡性程序性細胞死亡途徑更有意義[5-7]。本研究通過鐵死亡抑制劑以及程序性壞死抑制劑，利用實時無標記細胞功能分析法等方法證明SAS誘導(dǎo)卵巢癌親本細胞SKOV3和耐藥細胞SKOV3/DDP發(fā)生程序性壞死和鐵死亡途徑具有差異，與非耐藥細胞比較，耐藥細胞存在非凋亡性細胞死亡途徑。

柳氮磺吡啶(Sulfalsalazine，SAS)是Xc-系統(tǒng)抑制劑，抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體不僅會影響胱氨酸依賴的谷胱甘肽合成，還會抑制胱氨酸的跨膜穿梭，這兩種作用都會損壞細胞的抗氧化系統(tǒng)，增加ROS 的積累，在機體的抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。2012年，Dixon 等[9,10]新提出了一種叫做鐵死亡(ferroptosis)的鐵依賴性的細胞死亡形式。鐵死亡的作用機制可能與谷氨酸的氧化毒性類似，SAS等藥物通過胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運體抑制胱氨酸的吸收，從而破壞了細胞內(nèi)氧化還原平衡的調(diào)節(jié)并且最終形成依賴于鐵離子的氧化性死亡。也已證實SAS誘導(dǎo)順鉑耐受的肺小細胞癌細胞發(fā)生凋亡[11]，SAS誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251發(fā)生凋亡及自噬[12]。

細胞程序性壞死(Necroptosis)，又稱為壞死性凋亡，是一種既受死亡信號調(diào)控、又出現(xiàn)壞死樣結(jié)構(gòu)特點的死亡形式，是一種可被壞死抑制劑Necrostain-1( Nec-1) 抑制的新細胞死亡方式，并且由機體內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子如RIP1、RIP3、MLKL 等高度調(diào)控的過程[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]，ROS 的大量產(chǎn)生和積聚是RIP3 蛋白依賴的，而且糖原磷酸化酶(PYGL)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)和谷氨酸脫氫酶(GLUD1)參與調(diào)節(jié)。過量的ROS 使得線粒體膜的通透性改變誘發(fā)細胞程序性壞死。

本研究利用SAS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，再分別聯(lián)合鐵死亡抑制劑Fer-1和程序性壞死抑制劑Nec-1，結(jié)果顯示Fer-1及Nec-1與SAS聯(lián)合作用SKOV3細胞，均不能挽救SAS對SKOV3細胞生存率的抑制作用。與SKOV3細胞比較，F(xiàn)er-1作用24 h前挽救SAS對SKOV3/DDP細胞生存率的抑制作用，24 h后不能挽救SAS對SKOV3/DDP細胞生存率的抑制作用；Nec-1能全程性挽救SAS對SKOV3/DDP細胞生存率的抑制作用，表明耐藥細胞(SKOV3/DDP)均存在非凋亡性細胞死亡方式，即鐵死亡以及程序性壞死途徑，而非耐藥細胞(SKOV3)則不存在非凋亡性細胞死亡方式，推測可能只存在細胞凋亡途徑。接下來我們從蛋白水平上進一步證明。由于RIP1-RIP3 程序性壞死小體形成的必備條件之一，其作用底物為混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(MKLK)。MKLK 是程序性壞死通路中RIP3 下游路徑中的一個關(guān)鍵酶。因此我們利用Western blotting法檢測磷酸化MLKL蛋白表達情況。結(jié)果顯示，與SAS作用0h比較，SAS作用不同時間點，SKOV3細胞磷酸化MLKL蛋白表達沒有變化，而SKOV3/DDP細胞中磷酸化MLKL蛋白表達增強。本研究對比觀察到非耐藥細胞及耐藥細胞在氧化應(yīng)激條件下細胞死亡方式的差異，而且實時動態(tài)觀察到，氧化應(yīng)激在不同時程時，鐵死亡與程序性壞死途徑所占據(jù)的比重不同，在氧化應(yīng)激早期可見鐵死亡及程序性壞死，隨著氧化應(yīng)激時間延長，只存在程序性壞死。

Zhang 等人[15]發(fā)現(xiàn)，不表達RIP3 基因的A細胞(一種NIH-3T3 細胞系)在腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)下發(fā)生凋亡，而表達RIP3 基因的N 細胞(另一種NIH-3T3 細胞系)卻在TNF-α誘導(dǎo)下發(fā)生程序性壞死，表明RIP3在細胞程序性壞死與凋亡中的重要開關(guān)作用。由此可見，細胞死亡機制間構(gòu)成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，凋亡、自噬、程序性壞死等三種程序性壞死以及壞死，在非耐藥細胞及耐藥細胞中所占比例可能與腫瘤細胞本身狀態(tài)、腫瘤生存環(huán)境、化療藥物作用時間長短及損傷程度等因素密切相關(guān)。這四種死亡機制均參與化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡過程，且四者之間可能相互轉(zhuǎn)換、相互制約，在非耐藥細胞中可能某種機制占主導(dǎo)，但在耐藥細胞中可能共同參與化療藥物作用。

結(jié)合課題組前期研究結(jié)果，多功能蛋白P62蛋白在非耐藥細胞(SKOV3)中低表達，而在耐藥細胞(SKOV3/DDP)中高表達，根據(jù)兩種細胞死亡方式的不同，提示P62蛋白可能與腫瘤細胞的程序性壞死途徑有關(guān)。今后的研究中需要重點關(guān)注凋亡、程序性壞死和自噬在腫瘤化療藥物耐受中的作用，調(diào)控細胞死亡路徑之間的轉(zhuǎn)換將很好地拓寬治療惡性腫瘤的范圍。

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