山東省攜帶blaNDM-5基因大腸埃希菌的分子流行病學研究

李宜雷,趙 輝，賈 楠，董丹丹，劉真真，朱元祺，*

(1.青島大學醫(yī)學院，山東 青島266071；2.青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島266003)

碳青霉烯類抗生素被認為是目前臨床上治療革蘭氏陰性菌感染的最后一道防線。近年來隨著這類抗生素的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌(CRE)的分離率也呈上升趨勢[1,2]。新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1型(NDM-1)是一種常見的碳青霉烯酶，是Ambler分類中B類β-內(nèi)酰胺酶[3]。研究發(fā)現(xiàn)，近幾年不斷檢出該基因的不同亞型。新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-5型(NDM-5)是Hornsey[4]于2011 年報道的新亞型。隨后，陸續(xù)有在不同的國家和地區(qū)檢出產(chǎn)NDM-5腸桿菌的報道，且報道逐年增加。同NDM-1一樣，此類酶水解除氨曲南外的幾乎所有β內(nèi)酰胺類抗生素，常常也攜帶其他耐藥基因，表現(xiàn)對喹諾酮類、氨基糖苷類和四環(huán)素類等臨床常用抗生素耐藥，但Hornsey等[4]試驗還表明NDM-5酶的水解活性要高于NDM-1酶。因此，對攜帶blaNDM-5基因的腸桿菌進行研究，有助于針對性制定醫(yī)院感染預(yù)防和控制指南。為此，我們收集了山東省3家醫(yī)院臨床實驗室2015年3月-2016年12月間分離的20株對亞胺培南耐藥的大腸埃希菌，篩選其攜帶的blaNDM-5基因，然后對這些NDM-5陽性菌株的耐藥表型和耐藥基因型及其同源性進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集濟南、濟寧和青島市3家醫(yī)院于2015年 3月-2016年12月臨床分離的對亞胺培南耐藥的大腸埃希菌20株。這些菌株重新用法國梅里埃公司Vitek-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行細菌的鑒定和藥敏。藥物敏感性判定依據(jù)美國臨床實驗室標準化研究所2016 年 CLSI M100S-26標準執(zhí)行。儀器的質(zhì)控菌株為ATCC27853、ATCC25922、ATCC700323、ATCC700324、ATCC35218和ATCC700603，為本實驗室保存。沙門氏菌H9812 菌株(脈沖場凝膠電泳Marker)由青島市疾病控制中心惠贈。

1.2 主要儀器和試劑

PCR擴增儀、脈沖場凝膠電泳儀(CHEF-DR Ⅲ)和全自動凝膠成像系統(tǒng)均為美國Bio-Rad 公司。Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR buffer、DL2000maker、S1和 Xba I核酸酶購自大連寶生生物(Takara公司)。

1.3 耐藥基因分析

熱裂解法提取菌株DNA，首先PCR擴增和產(chǎn)物測序確定菌株攜帶的blaNDM-5基因，然后，再對陽性菌擴增其他碳青霉烯酶耐藥基因(KPC、IMP、VIM、OXA-48、BIC、SPM、AIM、GIM、SIM和SIM)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(TEM、SHV、CTX-M和OXA-1)、氨基糖苷和喹諾酮類耐藥基因[acc(6')Ib，qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS]。引物序列及 PCR 擴增參數(shù)參照文獻[5,6]。各引物合成和PCR 擴增產(chǎn)物由上海生工生物(上海)工程股份有限公司完成。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比對確定耐藥基因型。

1.4 多位點序列分型(MLST)

按照大腸埃希菌MLST 網(wǎng)站提供的7個管家基因的引物(adk，fumC，gyrB，icd，mdh，purA，recA)序列進行擴增，測序結(jié)果在該網(wǎng)站進行比對得出菌株的序列分型(http://enterobase.warwick.ac.uk/species/ecoli/allele_st_search)。

1.5 脈沖場凝膠電泳(PFGE)

對產(chǎn)NDM-5的大腸埃希菌進行PFGE分析，操作步驟和結(jié)果判讀參照Tenover相關(guān)文獻[5,7]。沙門菌H9812菌株和臨床菌株用限制性內(nèi)切酶XbaI一樣處理，并作為Marker。電泳參數(shù)：溫度14℃、分子量30 kb-700 kb、場強6 V/cm、轉(zhuǎn)角120°、轉(zhuǎn)換時間2.16-63.8 s、電泳時間18 h。

2 結(jié)果

2.1 攜帶blaNDM-5基因大腸埃希菌的藥敏結(jié)果

用法國梅里埃公司Vitek-2 Compact對收集分純后的20株大腸埃希菌重新進行細菌的鑒定和藥敏試驗，并PCR擴增和測序確定菌株是否攜帶NDM-5基因。經(jīng)檢測，其中11株大腸埃希菌攜帶blaNDM-5基因，且這11株菌對包括碳青霉烯酶類在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率最高，除對氨曲南耐藥率82%外，均高達100%耐藥率。對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的耐藥率也比較高，分別為54%、73%、73%和64%。僅有1株對左氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感，其余10株均呈現(xiàn)耐藥。但是，所有11株菌對呋喃妥因未出現(xiàn)耐藥(敏感率36%，中介率64%)。結(jié)果見表1和表2。

2.2 菌株耐藥基因檢測和多位點序列分型結(jié)果

除了經(jīng)擴增和測序比對確認11株菌攜帶blaNDM-5基因外，且每一株菌還攜帶多個其他耐藥基因，如CTX-M-55、OXA-1、TEM-1和acc(6')Ib等耐藥基因。11株菌中，6株分離自尿液，痰液和膿液各2株，血液1株。多位點序列分型顯示這11株大腸埃希菌共分為7個ST型，以ST167為主，共4株(36.4%，4/11)， 其他分別為ST617型2株(18.2%，2/11)，ST46、ST453、ST448、ST6388和ST410型各1株。詳見圖1和表2。

2.3 脈沖場凝膠電泳PFGE結(jié)果

脈沖場凝膠電泳結(jié)果顯示，經(jīng)與沙門菌H9812菌株比對，這11株大腸埃希菌的脈沖電泳條帶數(shù)目、位置均不相互一致，依據(jù)Tenover規(guī)則判定，都屬于暴發(fā)不相關(guān)(Unrelated)菌株，即山東省三個醫(yī)院雖然都存在攜帶blaNDM-5基因大腸埃希菌的流行，但在醫(yī)院內(nèi)或三個醫(yī)院間沒有呈現(xiàn)菌株的克隆聚集性，都屬于散發(fā)克隆。詳見圖2。

表1 11株攜帶blaNDM-5基因大腸埃希菌臨床株的藥敏結(jié)果(μg/mL)

表2 11株產(chǎn)NDM-5大腸埃希菌攜帶的耐藥基因和多位點序列分型

M：DL2000 marker；Lane1：NDM-5；Lane2：CTX-M；Lane3：TEM-1；Lane4：OXA-1 ；Lane5：陰性對照

圖1耐藥基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

自新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1型(New Delhi metallo-β-lactamase 1，NDM-1)2009年在印度首次報道[3]以來，攜帶該基因的細菌已被發(fā)現(xiàn)在全球范圍流行并引發(fā)多種類型感染[1,8]。攜帶blaNDM 菌由于編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因點突變，已報道有多個亞型，其中以NDM-1亞型最多見[8]。許多變異亞型(如NDM-2 和NDM-3)與NDM-1 具有相似的水解活性，原因在于酶活性中心部位沒有發(fā)生突變。blaNDM-5首次報道于1株ST648型大腸埃希菌，是 NDM 型碳青霉烯酶的另一種亞型，與 NDM-1只有 2個氨基酸的差別(Val88Leu，Met154Leu)，但比NDM-1具有更高的酶活性[4]。隨后，在英國、印度、阿爾及利亞、日本和中國也有被發(fā)現(xiàn)的報道[9-13]。

M：沙門菌H9812；Lane1-11：1-11號攜帶blaNDM-5基因大腸埃希菌

11株菌藥敏試驗顯示，除氨曲南外，對所有β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，同時對氨基糖苷類抗生素(阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素)、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、喹諾酮類抗生素(左氧氟沙星和環(huán)丙沙星)部分敏感。氨曲南的化學結(jié)構(gòu)與金屬β-內(nèi)酰胺活性位點(MBL)沒有足夠的分子交互作用，因而有兩株blaNDM-5大腸埃希菌對氨曲南沒有發(fā)生水解，但其他9株NDM-5大腸埃希菌由于攜帶其他β-內(nèi)酰胺酶等耐藥基因，因而氨曲南顯示耐藥。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑阿維巴坦對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶有作用，氨曲南和阿維巴坦混合物可能是治療產(chǎn)NDM耐藥菌感染的最佳方案，尤其是當其他β-內(nèi)酰胺酶存在時[14]。

11株菌除了攜帶blaNDM-5基因外，還攜帶多個其他耐藥基因。本試驗菌株82%攜帶CTX-M，55%攜帶acc(6’)Ib和TEM-1，27%攜帶OXA-1，呈現(xiàn)多重耐藥表型和基因型，這給臨床治療帶來了困難。MLST的結(jié)果表明11株大腸埃希菌屬于7種不同的ST分型，以ST167型為主，共4株，占36.4%， 其他分別為ST617型2株(18.2%)，ST46、ST453、ST448、ST6388和ST410型各1株。經(jīng)檢索，除了ST167和ST448型外[13,15]，攜帶blaNDM-5基因的ST617、ST46、ST453、ST6388和ST410型大腸埃希菌為國內(nèi)外首次報道。目前，國內(nèi)外尚未有NDM-5菌株引起暴發(fā)流行的報道。與之相符的是，我們的PFGE結(jié)果同樣呈現(xiàn)出不同的脈沖帶型，即來自山東省三家醫(yī)院菌株的同源性差異較大，均為散發(fā)病例。雖然，這些菌株未發(fā)現(xiàn)流行病學上的聯(lián)系，但鑒于攜帶blaNDM-5細菌的高水平耐藥，應(yīng)引起足夠的重視。

綜上所述，山東省三家醫(yī)院都檢測到攜帶blaNDM-5基因的大腸埃希菌，以ST167型為主，沒有呈現(xiàn)克隆聚集性，屬于散發(fā)病例。但是，山東省存在未見報道的多位點序列分型的攜帶blaNDM-5基因的大腸埃希菌的流行。因此，公共衛(wèi)生部門和醫(yī)院應(yīng)做好耐藥監(jiān)測和醫(yī)院感染預(yù)防和控制工作，防止克隆傳播引起的醫(yī)院感染暴發(fā)。

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